自噬參與胰高血糖素樣肽-2調(diào)節(jié)短腸綜合征腸適應(yīng)的作用研究.pdf

1、腸系膜血管病變?nèi)菀滓鹦∧c缺血或壞死，繼而一次或多次手術(shù)最終導(dǎo)致短腸綜合征(short bowel syndrome，SBS)的發(fā)生。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusioninjury，IRI)是腸道缺血后再灌注反而加重?fù)p傷的過程，參與到腸系膜血管病導(dǎo)致SBS的發(fā)病機(jī)制中。自噬(autophagy)是普通存在于原核和真核生物的以細(xì)胞自我吞噬為主要機(jī)制的一種保守現(xiàn)象。在饑餓或者外界壓力的刺激下，細(xì)胞自噬可以被誘發(fā)，因此I

2、RI在一定條件下同樣可以誘發(fā)自噬的發(fā)生。本課題研究的主要目的即是通過在動(dòng)物體內(nèi)模仿由于腸系膜血管病變導(dǎo)致SBS的臨床過程，進(jìn)而研究腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)自噬和凋亡的表達(dá)以及胰高血糖素樣肽-2（glucagon-like peptide-2，GLP-2）治療腸切除術(shù)后腸適應(yīng)(intestinal adaption)過程的分子機(jī)制和通過自噬和凋亡表達(dá)變化探討腸切除術(shù)后早期開始給予GLP-2治療的最佳時(shí)間。
　　第一部分 腸切除術(shù)后剩余腸

3、管自噬和凋亡的表達(dá)
　　研究目的：
　　本部分實(shí)驗(yàn)主要研究與假手術(shù)相比，腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)自噬和凋亡的表達(dá)情況。
　　研究方法：
　　(1)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組分別建立假手術(shù)，單純MBR以及IRI合并MBR的動(dòng)物模型;
　　(2)聯(lián)合電子顯微鏡(electron microscopy，EM)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction，PCR)和Western Blotting等多種實(shí)驗(yàn)方

4、法以及多種自噬標(biāo)志物包括LC3，P62，Atg5和Beclin-1以檢測自噬在腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá);
　　(3)通過Western印跡法檢測腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)凋亡相關(guān)蛋白二磷酸腺苷核糖多聚酶（Poly Adenosine Diphosphate Ribose Polymerase，PARP）和Caspase8的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　(1)電鏡結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)，腸切除術(shù)后腸組織中觀察到的自噬體的

5、數(shù)量顯著增加，腸切除術(shù)后72小時(shí)自噬體的數(shù)量明顯減少;
　　(2)與假手術(shù)相比，在mRNA水平上自噬標(biāo)志物L(fēng)C3，Atg5以及Beclin-1的表達(dá)在腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)均顯著增高，72小時(shí)上述標(biāo)志物的表達(dá)則明顯減少。與此同時(shí)P62的表達(dá)在腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)顯著減少，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);
　　(3)在蛋白水平上，結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化率以及LC3Ⅱ的表達(dá)最為顯著，同時(shí)Atg5

6、和beclin-1的表達(dá)亦明顯增加，72小時(shí)上述標(biāo)志物的蛋白表達(dá)則明顯減少。P62的表達(dá)在腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)顯著降低，而72小時(shí)則明顯增加，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001);
　　(4)凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase8在腸切除術(shù)后24小時(shí)無明顯變化，而在72小時(shí)和7天則顯著增加，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)。
　　研究結(jié)論：
　　與假手術(shù)相比，腸切除術(shù)后8小時(shí)，16小時(shí)和24小時(shí)，自噬無論在mR

7、NA還是在蛋白水平上的表達(dá)均有明顯增高，IRI合并MBR后自噬標(biāo)志物的表達(dá)增高更為顯著。與此同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)在腸切除術(shù)后24小時(shí)并未有明顯增高。腸切除術(shù)后72小時(shí)自噬的表達(dá)較前有所降低，而凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)則顯著增高，腸切除術(shù)后7天凋亡的表達(dá)趨于穩(wěn)定。由此可以得出腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)自噬過度表達(dá)，可能啟動(dòng)類似于凋亡的自噬性細(xì)胞死亡，同時(shí)可以拮抗凋亡的作用。腸切除術(shù)后72小時(shí)自噬的表達(dá)逐漸降低進(jìn)而主要發(fā)揮對(duì)腸道組織保護(hù)性的機(jī)制，與此

8、同時(shí)凋亡的表達(dá)則逐漸增加，從而刺激腸道粘膜的自我更新，促進(jìn)腸切除術(shù)后腸適應(yīng)的進(jìn)程。
　　第二部分 自噬參與胰高血糖素樣肽-2治療腸切除術(shù)后腸適應(yīng)過程的分子機(jī)制
　　研究目的：
　　本部分實(shí)驗(yàn)主要驗(yàn)證與給予生理鹽水治療相比，腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)給予GLP-2治療后，可能通過Akt-mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬的表達(dá)進(jìn)而參與到腸切除術(shù)后腸適應(yīng)過程中。同時(shí)還驗(yàn)證GLP-2治療后對(duì)腸切除術(shù)后腸道粘膜損傷的保護(hù)作用。
　　研究

9、方法：
　　(1)在第一部分動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)分別開始連續(xù)3天分別給予腹腔注射同等劑量的GLP-2和生理鹽水;
　　(2)免疫組化（immnohistochemistry，IHC）檢測腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)給予GLP-2治療后GLP-2受體的表達(dá)情況;
　　(3)Western Blotting檢測腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)治療后Akt-mTOR信號(hào)通路中Akt，mTOR和4EBP1分子的表達(dá)情況;

10、　　(4)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和蘇木精-伊紅染色(hematoxylineosin staining，HE)分別檢測腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)給予GLP-2治療后腸道中炎癥因子乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的表達(dá)和腸道粘膜損傷的評(píng)估。
　　研究結(jié)果：
　　(1)IHC結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時(shí)給予GLP-2治療后GLP-2

11、R表達(dá)顯著增加，72小時(shí)治療后則表達(dá)明顯減少，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001);
　　(2)Western結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，腸切除術(shù)后16小時(shí)給予GLP-2治療后信號(hào)通路相關(guān)分子Akt，mTOR及4EBP-1的表達(dá)開始顯著增加，24小時(shí)治療后相關(guān)分子表達(dá)達(dá)到峰值，而72小時(shí)治療后表達(dá)則有所降低，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001);
　　(3)ELISA結(jié)果顯示腸切除術(shù)后給予GLP-2治療后LDH的表達(dá)均有所降低

12、，但是無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.282);
　　(4)病理切片染色結(jié)果顯示腸切除術(shù)后給予GLP-2治療后腸道粘膜損傷評(píng)分明顯降低，尤以24小時(shí)治療時(shí)效果最為顯著，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)。
　　研究結(jié)論：
　　總的來說，與對(duì)照組相比，腸切除術(shù)后24小時(shí)給予GLP-2治療后可通過與高表達(dá)的GLP-2R結(jié)合后激活A(yù)kt-mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控自噬的表達(dá)參與到腸切除術(shù)后腸適應(yīng)的過程中。但是推測在治療后的腸適

13、應(yīng)的過程中可能還有PI3K-beclin-1等其它自噬相關(guān)信號(hào)通路的參與。與此同時(shí)，腸切除術(shù)后給予GLP-2治療后腸道粘膜的炎癥反應(yīng)無明顯差異但對(duì)腸道粘膜損傷有顯著保護(hù)作用。
　　第三部分 通過自噬和凋亡的表達(dá)變化探討腸切除術(shù)后早期給予GLP-2治療的最佳時(shí)間
　　研究目的：
　　本部分實(shí)驗(yàn)主要與生理鹽水治療相比，通過腸切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)給予GLP-2治療后自噬和凋亡的表達(dá)情況來進(jìn)一步探討腸切除術(shù)后早期給予GLP-2腸

14、康復(fù)治療的最佳時(shí)間。
　　研究方法：
　　(1)動(dòng)物模型同第二部分;
　　(2)除了第一部分自噬和凋亡的檢測方法以外還使用IHC和末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)分別檢測自噬和凋亡的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　(1)電鏡結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)給予GLP-2治療后自噬體數(shù)量減少

15、最為顯著，72小時(shí)治療后自噬體數(shù)量有所增加;
　　(2)在mRNA水平上，腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)給予GLP-2治療后自噬標(biāo)志物L(fēng)C3，Atg5，beclin-1表達(dá)顯著降低，尤其以24小時(shí)治療后最為明顯，與此同時(shí)P62的表達(dá)在治療后明顯增加，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001);
　　(3)Western的結(jié)果表明腸切除術(shù)后24小時(shí)給予GLP-2治療后LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化率及LC3Ⅱ的表達(dá)明顯降低，同時(shí)Atg5，Becl

16、in-1的表達(dá)也在治療后被明顯抑制，而P62的表達(dá)則在治療后顯著增加。72小時(shí)治療后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著增加，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001);
　　(4)凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase8在腸切除術(shù)后24小時(shí)內(nèi)給予GLP-2治療后無明顯變化，腸切除術(shù)后72小時(shí)治療后凋亡的表達(dá)明顯受抑制，7天治療后凋亡的表達(dá)有所增加，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001);
　　(5)IHC的結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時(shí)治療后LC

17、3，Atg5以及Beclin-1表達(dá)明顯減少，而P62表達(dá)明顯增加，72小時(shí)治療后LC3，Atg5以及Beclin-1表達(dá)明顯增加，而P62表達(dá)明顯減少，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);
　　(6)TUNEL的結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時(shí)治療后凋亡小體的數(shù)量無明顯變化，而72小時(shí)治療后凋亡小體的數(shù)量明顯減少，7天治療后其數(shù)量顯著增加，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)。
　　研究結(jié)論：
　　腸切除術(shù)后8小時(shí)和1