胰高血糖素樣肽-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸黏膜屏障損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、全腸外營養(yǎng)(total parenteral nutrition，TPN)應(yīng)用于臨床治療已有近半個世紀(jì)，它不但可以維護(hù)機(jī)體正常生理活動所需的營養(yǎng)物質(zhì)與能量，而且還可改善營養(yǎng)狀況和促進(jìn)康復(fù)。目前，TPN已在臨床廣乏應(yīng)用于腸衰竭病人的救治，特別是短腸綜合征的營養(yǎng)支持。然而，長期的TPN支持會導(dǎo)致腸道黏膜萎縮、破壞，免疫功能障礙，從而增加腸道細(xì)菌易位和感染并發(fā)癥等風(fēng)險的發(fā)生，嚴(yán)重的甚至可導(dǎo)致腸源性敗血癥，但其機(jī)制仍未完全明確。如何有效地避免或

2、減少TPN治療所導(dǎo)致的這些并發(fā)癥發(fā)生是當(dāng)前外科營養(yǎng)治療領(lǐng)域的重要問題。
　　胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)是一種腸道特異性的生長因子，它具有增加腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善腸道血流的供應(yīng)，促進(jìn)腸黏膜損傷的修復(fù)與維持腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性等作用，近年來越來越受到學(xué)者的關(guān)注。GLP-2與其他多肽類生長因子不同的是其發(fā)揮生理功能或藥理作用強(qiáng)，且具有特異性（僅局限于胃腸道），在應(yīng)用于治療腸道屏障功

3、能障礙的疾病中前景廣闊。
　　替度魯肽(Teduglutide)是一種人GLP-2的類似物，目前用在治療短腸綜合征和炎癥性腸病進(jìn)行了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并已取得了良好的療效。研究表明，外源性補(bǔ)充GLP-2類似物可以使短腸綜合征病人減少對腸外營養(yǎng)的依賴和改善其生活質(zhì)量。短腸綜合征病人的腸內(nèi)外營養(yǎng)支持治療的最終目的之一是希望能夠擺脫腸外營養(yǎng)，依靠腸內(nèi)營養(yǎng)甚至口服進(jìn)食來維持生存。但長期的TPN治療可導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損，甚至發(fā)生細(xì)菌易位和

4、感染并發(fā)生癥等風(fēng)險，而治療短腸綜合征的新藥—GLP-2類似物具有特異性地修復(fù)腸上皮細(xì)胞以及維持腸黏膜屏障的完整性等作用，因此，探討GLP-2對TPN導(dǎo)致的腸黏膜屏障損傷具有十分重要的臨床意義。
　　長期的TPN支持不僅可以導(dǎo)致腸黏膜機(jī)械屏障的損傷，而且還會引起腸黏膜免疫屏障的破壞。最近研究表明，GLP-2不但可保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障，而還可能在腸道黏膜免疫反應(yīng)中起著重要的作用。在休克復(fù)蘇大鼠模型中，GLP-2可以增加大鼠膽汁中的sIg

5、A分泌水平;在給予GLP-2治療重癥急性胰腺炎的小鼠中發(fā)現(xiàn)，該組小鼠腸黏膜的CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞和IgAλ表達(dá)水平增加，這進(jìn)一步說明了GLP-2對腸道黏膜免疫屏障有一定的保護(hù)作用。但目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)GLP-2對TPN動物模型的腸黏膜免疫屏障影響的相關(guān)研究。
　　針對TPN導(dǎo)致的腸黏膜屏障損傷所帶來一系列并發(fā)癥這一常見的臨床問題，并鑒于GLP-2對腸道黏膜上皮細(xì)胞有較確切的保護(hù)作用，我們設(shè)計動物實(shí)驗(yàn)來探討G

6、LP-2對TPN動物模型腸黏膜屏障的影響。我們首先通過頸外靜脈置管建立TPN小鼠模型，觀察GLP-2是否可以預(yù)防TPN導(dǎo)致的腸黏膜萎縮。更進(jìn)一步的研究是，觀察GLP-2是否可以保護(hù)TPN導(dǎo)致的腸黏膜機(jī)械屏障損傷以及其相關(guān)的保護(hù)機(jī)制。另一方面，我們也初步探討GLP-2是否可改善TPN所致的腸粘膜免疫損傷。
　　第一章 GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道萎縮的預(yù)防作用
　　目的：
　　探討GLP-2對全腸外營養(yǎng)(TPN)導(dǎo)致的

7、腸道萎縮的影響。
　　方法：
　　選取6-8周健康ICR小鼠（n=24，33.6±1.1），隨機(jī)平均分為3組:自由進(jìn)食組（Chow組）、全腸外營養(yǎng)組（TPN組）和全腸外營養(yǎng)+注射GLP-2組(TPN+GLP-2組)。氯胺酮腹腔注射進(jìn)行麻醉，頸外靜脈置管2d后，TPN組給予全腸外營養(yǎng)液，TPN+GLP-2組除給予等量上述營養(yǎng)液外還經(jīng)頸外靜脈注射30ug/次GLP-2，一天2次（共60ug/d）。每天定時稱量小鼠體重，于第7d處

8、死小鼠，取出小腸并測量，留取回腸末端組織檢測相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)量，并觀察腸黏膜的形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果：
　　與chow組比較，TPN組小鼠的體重下降明顯，小腸長度明顯縮短，小腸絨毛高度和微絨毛變矮以及隱窩深度變淺（均P＜0.05）。而GLP-2組小鼠的上述指標(biāo)均有所改善（均P＜0.05）。GLP-2可增加TPN小鼠腸組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白與mRNA的表達(dá)，減少腸組織cleaved caspase-3蛋白的

9、表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　GLP-2可以預(yù)防TPN小鼠腸黏膜萎縮，其機(jī)制可能是通過刺激腸上皮組織PCNA蛋白與mRNA的表達(dá)以及減少cleaved caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　第二章 GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道機(jī)械屏障的影響
　　目的：
　　探討GLP-2對全腸外營養(yǎng)（TPN）小鼠腸道機(jī)械屏障的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　將36只正常健康ICR小鼠隨機(jī)平均分為3組:自由進(jìn)食組(

10、Chow組)、全腸外營養(yǎng)組（TPN組）和全腸外營養(yǎng)+注射GLP-2組（TPN+GLP-2組）。經(jīng)頸外靜脈置管2d后，TPN組給予全腸外營養(yǎng)液，TPN+GLP-2組除給予等量上述營養(yǎng)液外還注射30ug/次GLP-2，一天2次（共60ug/d）。在第7d處死小鼠，留取眼球靜脈血，留取回腸末端組織檢測相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)，使用透射電子顯微鏡觀察腸黏膜組織的形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果：
　　與Chow組比較，TPN組小鼠血清IL-6和

11、TNF-α水平顯著升高，而IL-10下降（均P＜0.05），與TPN組比較，TPN+GLP-2組血清的IL-6和TNF-α水平降低，IL-10水平升高（均P＜0.05）。TPN、TPN+GLP-2組的IL-6、TNF-α和IL-10的mRNA表達(dá)也與其血清水平變化相一致（均P＜0.05）。與Chow比較，TPN組小鼠的血漿內(nèi)毒素和D-乳酸水平升高（均P＜0.05），而TPN+GLP-2組的變化不明顯（均P＞0.05）。與Chow組比較，

12、TPN組小鼠的MPO含量與Caspase-3活性增加(P＞0.05)，而TPN+GLP-2組的變化不顯著（均P＞0.05）。電鏡觀察結(jié)果顯示，與Chow組比較，TPN組小鼠微絨毛稀少，排列不齊，出現(xiàn)倒伏、脫落，緊密連接蛋白遭到破壞，而TPN+GLP-2組的微絨毛稍整齊，緊密連接蛋白破壞不明顯;免疫熒光結(jié)果表明，與Chow組比較，TPN組腸組織的緊密連接Occludin、Caudin-1和ZO-1蛋白熒光較少，不連續(xù)，而TPN+GLP-2

13、組的變化不明顯。Western blot結(jié)果顯示，與Chow組比較，TPN組小鼠腸組織的緊密連接蛋白Occludin、Caudin-1表達(dá)減少（均P＜0.05），而TPN+GLP-2組的與Chow組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。TPN組小鼠腸組織PCNA、Bel-2蛋白表達(dá)減少（均P＜0.05），而Bax蛋白表達(dá)增加（均P＜0.05）;相反，TPN+GLP-2組的變化與Chow組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

14、　　結(jié)論：
　　1.TPN支持5天后可導(dǎo)致小鼠腸黏膜機(jī)械屏障受損，表現(xiàn)為促炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，血漿內(nèi)毒素增加，緊密連接蛋白遭到破壞等。
　　2.GLP-2可改善TPN導(dǎo)致的腸黏膜機(jī)械屏障損傷，其體現(xiàn)在GLP-2可減輕腸組織的病理損傷及緊密連接蛋白損傷，降低腸黏膜通透性，降低炎癥因子的表達(dá)等。
　　3.GLP-2保護(hù)TPN導(dǎo)致的腸黏膜機(jī)械屏障損傷機(jī)制可能是促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖、抑制其細(xì)胞凋亡以及減輕腸組織炎癥反應(yīng)，從而對腸黏

15、膜機(jī)械屏障起保護(hù)作用。
　　第三章 GLP-2對全腸外營養(yǎng)小鼠腸道免疫屏障的影響
　　目的：
　　探討GLP-2對全腸外營養(yǎng)(TPN)小鼠腸道黏膜免疫屏障的影響。
　　方法：
　　將30只6-8周的健康ICR小鼠隨機(jī)平均分為3組:自由進(jìn)食組（Chow組）、全腸外營養(yǎng)組（TPN組）和全腸外營養(yǎng)+注射GLP-2組（TPN+GLP-2組）。在頸外靜脈置管2d后，TPN組給予全腸外營養(yǎng)液，TPN+GLP-2組除給予

16、等量上述營養(yǎng)液外還注射30ug/次GLP-2，一天2次（共60ug/d）。第7d后處死小鼠，留取門靜脈血檢測細(xì)菌易位率，留取小腸腸腔沖洗液檢測sIgA含量，取回腸末端組織檢測IL-4、IL-13等相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)，檢測回腸末端組織sIgA水平，并做相關(guān)蛋白的免疫熒光染色檢測，留取回腸末端組織作PAS染色觀察小腸杯狀細(xì)胞數(shù)目的變化。
　　結(jié)果：
　　與TPN組比較，TPN+GLP-2組小鼠的回腸組織杯狀細(xì)胞數(shù)目明顯增多

17、，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ELISA結(jié)果顯示，與Chow組比較，TPN組小鼠的腸組織和沖洗液中的sIgA含量、腸組織IL-4和IL-13水平均減少（均P＜0.05）。而與TPN組比較，TPN+GLP-2組的腸組織和沖洗液中sIgA含量、腸組織IL-4和IL-13水平均有所增加（均P＜0.05）。與Chow組比較，TPN顯著減少腸組織的sPLA2和cryptdin-4的水平（均P＜0.05），而與TPN組比較，注射GLP-2后可

18、改善腸組織的sPLA2和cryptdin-4水平（均P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與TPN組比較，TPN+GLP-2組的lysozyme與PIgR蛋白表達(dá)均增加（均P＜0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與TPN組比較，TPN+GLP-2組小鼠的IL-4 mRNA、IL-13mRNA、Lysozyme mRNA、pIgR mRNA、SPLA2 mRNA、Mucin2 mRNA和Cryptdin4 mRNA表達(dá)均增加（

19、均P＜0.05），但Tff3 mRNA與RegⅢ-γ mRNA的表達(dá)均無明顯差異。另外，與TPN組比較，TPN+GLP-2組小鼠血清中精氨酸和瓜氨酸水平顯著升高（均P＜0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示，與TPN組比較，TPN+GLP-2組的Lysozyme和PIgR蛋白熒光較多，且較連續(xù)。另外與TPN組比較，TPN+GLP-2組的門靜脈血、肝與脾的總的細(xì)菌易位率明顯降低（均P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.TPN可導(dǎo)致腸黏膜