表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌α-β2-ε-β1毒素的重組干酪乳桿菌的安全性評價及免疫效果的分析.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）屬于梭菌屬(Clostridium)，是創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及動物壞死性腸炎、腸毒血癥等多種疾病的主要病原菌。菌體分泌的外毒素是其主要的致病因子，可以產(chǎn)生多達(dá)16種，根據(jù)產(chǎn)生的外毒素種類不同，可分為A、B、C、D和E5個血清型，其中α、β、ε和ι是最主要的外毒素。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染是人、多種家畜、經(jīng)濟動物、野生動物最常見的一種人獸共患病，其發(fā)病急、死亡快，給我國畜牧業(yè)

2、發(fā)展帶來巨大的經(jīng)濟損失。疾病的發(fā)生通常是通過多種毒素共同作用引起，用單一毒素為免疫原制備的疫苗不能有效的抵抗異源毒素的攻擊，因此制備多種毒素的免疫原，對于預(yù)防該疾病的發(fā)生更具有實際意義。
　　本研究首先對實驗室構(gòu)建的重組干酪乳桿菌pPG-2-α-β2-ε-β1/L.casei393進行生物安全評價。通過重組干酪乳桿菌在消化環(huán)境中生存性能及口服后在動物消化道內(nèi)的定植能力、對兔子生產(chǎn)性能、血液理化指標(biāo)、組織病理學(xué)、釋放到環(huán)境中的能力進

3、行研究。結(jié)果顯示該重組干酪乳桿菌在pH值為4.5的胃液環(huán)境中作用5h后存活率為14.96％。在腸液環(huán)境中作用不同時間以后，在各個時間點均能檢測到活菌數(shù)而且其存活率均大于2％，對2％膽鹽濃度和8％的鹽濃度具有良好的耐受能力。口服重組菌后第14d，仍保持較高的定植率，分別為15.1％，25.3％，48.2％，29.3％，可知重組菌在動物機體內(nèi)各個腸段的定植能力都不一樣，并且其在盲腸中的定植率最高?？诜臃N后未引起中毒反應(yīng)和死亡，動物日采食量

4、和日增重量與PBS組相比有明顯的提高，且對兔子的血液生理指標(biāo)和肝、腎功能等均無影響，組織病理學(xué)觀察各組織也未發(fā)現(xiàn)病理學(xué)變化。通過PCR方法對飼料、飲水、籠子拭子、墊料樣品進行檢測，結(jié)果顯示均未檢測到重組干酪乳桿菌，表明重組干酪乳桿菌經(jīng)口服后沒有釋放到環(huán)境中。
　　為了進一步探討重組干酪乳桿菌的免疫效果，本研究用產(chǎn)氣莢膜梭菌易感動物兔子作為實驗動物，進行口服免疫。實驗動物分為三組，實驗Ⅰ組口服免疫pPG-2-α-β2-ε-β1/L.

5、casei393重組菌，劑量為5×1010CFU/只;實驗Ⅱ組每只兔子口服同等劑量的pPG-2/L.casei393;實驗組Ⅲ口服同等劑量的PBS溶液。免疫程序為:共免疫三次，每次免疫間隔時間為2w，每次連續(xù)免疫3d，每天免疫1次。于免疫后不同時間收集動物糞便、鼻腔沖洗液和血清，分別測定了糞便、鼻腔沖洗液中特異性sIgA水平以及血清中特異性IgG水平。ELISA檢測結(jié)果表明，口服免疫重組干酪乳桿菌后，糞便、鼻腔沖洗液樣品中均檢測到了較高

6、水平的特異性sIgA，與空載體組、PBS組比較，結(jié)果差異顯著，同時在血清中也檢測到了較高水平的特異性IgG抗體，表明口服重組干酪乳桿菌既可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生局部的黏膜免疫應(yīng)答，又可刺激機體產(chǎn)生系統(tǒng)的體液免疫應(yīng)答。第三次免疫后7天，進行了毒素攻毒實驗和組織病理學(xué)觀察，以檢測分析口服重組干酪乳桿菌對動物的保護作用。試驗結(jié)果顯示，免疫重組干酪乳桿菌后產(chǎn)生的特異性抗體能夠完全抵抗1LD100的產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素的攻擊。
　　綜上，口服重組干酪