產(chǎn)氣莢膜梭菌四聯(lián)外毒素基因α-β2-ε-β1在重組干酪乳酸桿菌表達(dá)及遺傳穩(wěn)定性分析.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C.perfringens）是革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛分布于自然界中，是引起人和動(dòng)物多種疾病的病原菌，常見(jiàn)于腸道感染，如食物中毒、壞死性腸炎、創(chuàng)傷性氣性壞疽及腸毒血癥等。其中，外毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要致病因子，包括α、β、ε和ι毒素，以α、β、ε毒素常見(jiàn)?；诋a(chǎn)氣莢膜梭菌的危害性及其病原菌和毒素經(jīng)腸道感染和吸收等特點(diǎn)，本研究以益生性干酪乳桿菌作為免疫原傳遞的活菌載體，以EGFP為

2、篩選標(biāo)記，構(gòu)建非抗性標(biāo)記的融合表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β2、ε和β1外毒素的重組干酪乳酸桿菌系統(tǒng)，以期為各型產(chǎn)氣莢膜梭菌病免疫預(yù)防提供重要得物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　將編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β2、ε和β1毒素的基因進(jìn)行融合（α-β2-ε-β1），定向插入至乳酸桿菌組成型表面表達(dá)載體pPG-T7g10-PPT，重組質(zhì)粒命名為pPG-α-β2-ε-β1。然后，將編碼增強(qiáng)型綠熒光蛋白(EGFP)基因連入重組質(zhì)粒pPG-α-β2-ε-β1（位于目的基因α

3、-β2-ε-β1前），構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPG-E-α-β2-ε-β1。利用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pPG-E-α-β2-ε-β1轉(zhuǎn)入Lactobacillus casei393中，獲得了重組干酪乳酸桿菌pPG-E-α-β2-ε-β1/L.casei393。當(dāng)pPG-E-α-β2-ε-β1/L.casei393重組菌傳至3～4代后，其中的目的基因α-β2-ε-β1發(fā)生缺失突變，經(jīng)PCR、酶切鑒定及測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，目的基因由α-β2-ε-β1變?yōu)棣?/p>

4、-β1、β2和ε基因發(fā)生遺傳缺失，而將重組菌連續(xù)傳代培養(yǎng)50代時(shí)，缺失變短后的目的基因α-β1可以穩(wěn)定遺傳。將重組質(zhì)粒pPG-E-α-β2-ε-β1在大腸桿菌TG1中連續(xù)傳50代，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)目的基因缺失，說(shuō)明目的基因遺傳缺失與宿主菌相關(guān)。
　　通過(guò)對(duì)融合基因α-β2-ε-β1的基因序列分析，發(fā)現(xiàn)目的基因之間的連接采用了相同的linker編碼基因序列(GPGPYV)，由此推測(cè)linker的使用可能是導(dǎo)致目的基因在干酪乳酸桿菌中遺傳不

5、穩(wěn)定性的因素。為驗(yàn)證這一推測(cè)，將編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β32、ε和β1外毒素的基因采用不同linker進(jìn)行串聯(lián)，克隆至表達(dá)載體pPG-T7g10-PPT，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法重新構(gòu)建了以EGFP為篩選標(biāo)記的重組干酪乳酸桿pPG-E-α-β2-ε-β31'/L.casei393。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將重組干酪乳酸桿菌pPG-E-α-β2-ε-β1'/L.casei393連續(xù)傳代培養(yǎng)，目的基因未發(fā)生遺傳缺失;經(jīng)Western blot方法鑒定融合蛋白獲得