江西部分地區(qū)哺乳仔豬含β2毒素基因的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分子流行病學(xué)調(diào)查及拮抗CpA的乳酸桿菌篩選.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，Cp）是引起家畜動(dòng)物梭菌性腸炎的重要病原菌之一，因該菌所產(chǎn)生的不同毒素組合依次可以將其分為A、B、C、D、E五種毒素型。其中A和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌是豬的主要腸道致病菌。以往認(rèn)為仔豬梭菌性腸炎（Clostridial enteritis of piglets）主要由C型Cp(CpC)引起，近年來(lái)，有關(guān)A型Cp(CpA)引起仔豬梭菌性腸炎的報(bào)道越來(lái)越多，該菌分泌的β2毒素在引起新生

2、仔豬腸炎的原因中扮演重要的角色。由于細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題，對(duì)于仔豬梭菌性腸炎的防治越來(lái)越困難，而乳酸桿菌對(duì)Cp菌有明顯的抑制作用。因此本研究?jī)?nèi)容:(1)對(duì)江西地區(qū)含β2毒素基因的A型Cp(CpA-β2)在哺乳仔豬中的分子流行情況進(jìn)行調(diào)查;(2)對(duì)健康和腹瀉哺乳仔豬腸道菌群進(jìn)行多樣性分析;(3)從健康哺乳仔豬腸道內(nèi)容物篩選拮抗CpA的乳酸桿菌;(4)進(jìn)行飼料添加類(lèi)抗生素對(duì)CpA的體外抑制試驗(yàn)研究;(5)進(jìn)行CpA的β2毒素基因克隆與表達(dá)試驗(yàn)研

3、究。
　　本研究通過(guò)PCR技術(shù)手段，建立多重PCR方法檢測(cè)江西地區(qū)哺乳仔豬CpA-β2攜帶率，結(jié)果顯示，在255個(gè)哺乳仔豬糞樣中（健康101和腹瀉154），96％(245/255)的樣品檢測(cè)出均只有A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在，而且均攜帶β2毒素基因;從所有哺乳仔豬糞樣分離到的229株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，且健康和腹瀉哺乳仔豬之間的菌株分離率差異不顯著。
　　通過(guò)細(xì)菌16SrDNA高變區(qū)DGGE和高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)健康

4、和腹瀉哺乳仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，腹瀉明顯影響仔豬腸道菌群多樣性，且菌群多樣性減少;腹瀉哺乳仔豬糞樣中梭桿菌屬（Fusobacterium）為優(yōu)勢(shì)菌群，與健康組比較比例更高(21.78％)，而乳桿菌屬(Lactobacillus)比例更低(0.12％)，這表明梭桿菌屬（Fusobacterium）與哺乳仔豬腹瀉有很大關(guān)系;乳桿菌屬(Lactobacillus)對(duì)梭桿菌屬（Fusobacterium）在哺乳仔豬腸道的定植很可能

5、具有抑制作用。
　　選取乳酸桿菌選擇培養(yǎng)基MRS對(duì)健康哺乳仔豬糞樣進(jìn)行乳酸桿菌篩選及拮抗CpA試驗(yàn)，并對(duì)篩選菌株進(jìn)行抗逆性試驗(yàn)，最后在212株乳酸桿菌中篩選出3株乳酸桿菌候選菌株，經(jīng)生化和16 SrDNA分子鑒定分別為兩株唾液乳酸桿菌和一株植物乳酸桿菌。
　　對(duì)臨床上多種飼料添加類(lèi)抗生素進(jìn)行體外抑制CpA試驗(yàn)研究，結(jié)果得出恩拉霉素、喹乙醇和15％桿菌肽鋅均有較好的抑菌效果。
　　利用分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)，成功克隆與表達(dá)了C