缺血后處理對腦缺血再灌注大鼠TLR4-TRIF信號轉導途徑的影響.pdf

1、目的：缺血后處理（ischemic post-conditioning, IPO）能夠激發(fā)機體內(nèi)源性保護作用，減輕缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）后的炎癥反應，但具體作用機制目前尚不明確。本課題旨在探討 IPO對局灶性腦缺血再灌注大鼠 Toll樣受體4（Toll-like receptor4, TLR4）- Toll/IL-1受體結構域接頭分子（Toll-interleukin1 receptor dom

2、ain-containing adapter-inducing interferon-b, TRIF）信號轉導途徑的影響，進一步闡述IPO的神經(jīng)保護機制，為臨床應用IPO治療缺血性卒中提供理論依據(jù)。
　　方法：研究選用130只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠并隨機分為假手術組（sham組）30只，模型組和干預組各50只，sham組根據(jù)手術后，模型組和干預組根據(jù)再灌注后時間點隨機分為6h、12h、24h、48h和72h5

3、個亞組，sham組每個亞組各6只，模型組和干預組每個亞組各10只。后兩組采用Zea-longa線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。sham組僅手術暴露頸總動脈及分叉處，不阻斷大腦中動脈。在再灌注開始時即模型建立后2h對干預組大鼠進行IPO處理（即術后2 h將栓線拔出至頭部位于頸總動脈分叉處，10s后再將栓線置入初始位置10s，如此重復6次）。對模型組大鼠僅拔出

4、栓線，不給予IPO處理。于再灌注后6h、12h、24h、48h、72h等時間點，采用Menzies法進行神經(jīng)功能缺損評分；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色觀察腦梗死體積；原位末端標記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）法檢測缺血側腦組織細胞凋

5、亡；實時定量熒光 PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）檢測大鼠缺血側顳、頂葉皮質TLT4-TRIF信號轉導途徑的特異性結構分子及關鍵細胞因子 TLR4、TRIF、TRIF相關的接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)、干擾素調節(jié)因子3(interferon regulatory factor3, IRF-3)及β干擾素（interferon-β, INF-β）

6、等的mRNA表達；免疫組織化學（immunohistochemistry）檢測大鼠缺血側腦組織中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等結構分子及關鍵細胞因子蛋白陽性細胞的分布與表達；免疫印跡法(western blotting)定量檢測大鼠缺血側顳、頂葉皮質中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等結構分子及關鍵細胞因子的蛋白表達。
　　結果：模型組、干預組大鼠都出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損及缺血側大腦

7、半球梗死。相比模型組，干預組大鼠神經(jīng)功能缺損評分得到顯著改善（t=2.963～5.262，P＜0.05），腦梗死體積明顯減少（t=3.341～3.875，P＜0.05），凋亡細胞計數(shù)明顯減少（t=2.332～3.643，P＜0.05）。模型組和干預組TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-βmRNA和蛋白表達于再灌注6h時已顯著升高。qPCR結果顯示干預組TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及 IFN-β mRNA表達較模

8、型組各對應時間點顯著降低（t=2.240～6.587，P＜0.05），免疫組織化學檢測結果顯示TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白陽性細胞主要位于缺血側額、顳葉皮質，干預組陽性細胞計數(shù)較模型組各對應時間點顯著降低（t=2.256～8.180，P＜0.05）。Western blotting檢測結果顯示干預組 TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白表達較模型組各對應時間點顯著降低（t=2.943～8.