RP105調(diào)控TLR4-TRIF信號通路對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：RP105重組腺病毒載體在體感染大鼠心肌細(xì)胞，研究RP105調(diào)控TLR4/TRIF信號通路對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其分子機(jī)制，為基因治療MIRI提供理論依據(jù)。
　　方法：本實驗采用SPF級雄性SD大鼠(220-250g)40只，隨機(jī)分為4組(n=10)：(1)生理鹽水+假手術(shù)(Sham組)；(2)生理鹽水+IR(IR組）；(3)Ad-EGFP-RP105+IR(Ad-RP105組)；(4)Ad-EGFP+IR(

2、Ad-EGFP組)。將構(gòu)建的攜帶RP105的重組腺病毒載體(Ad-EGFP-RP105)、空載病毒(Ad-EGFP)或生理鹽水在體感染大鼠心肌，穩(wěn)定感染3天后通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建MIRI模型(缺血30min再灌注2h)。免疫熒光觀察腺病毒感染大鼠心后目的基因RP105在心肌細(xì)胞的表達(dá)情況；血生化分析測定血清心肌酶LDH和CK-MB水平；Evans blue/TTC雙染法檢測大鼠心肌梗死面積；HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)；ELIS

3、A監(jiān)測大鼠心肌炎癥因子IFN-β和TNF-α的水平；Western檢測大鼠心肌TLR4/TRIF信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況；PCR檢測大鼠心肌TLR4/TRIF信號通路相關(guān)基因表達(dá)情況；EMSA檢測大鼠心肌核轉(zhuǎn)錄因子IRF3的DNA結(jié)合活性。
　　結(jié)果：(1)RP105重組腺病毒載體成功感染心肌組織，并且RP105成功表達(dá)至心肌細(xì)胞。(2)與Sham組相比，IR組血清心肌酶LDH和CK-MB的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；Ad-

4、RP105組的LDH和CK-MB的表達(dá)水平較IR組或Ad-EGFP組明顯下降(P<0.05)。(3)與Sham組相比，IR組心肌梗死面積顯著增加(P<0.05)；Ad-RP105組心肌梗死面積較IR組或Ad-EGFP組明顯減少(P<0.05)。(4)與Sham組相比，IR組可見細(xì)胞變性、細(xì)胞壞死等病理改變；Ad-RP105組心肌細(xì)胞變性壞死較IR組或Ad-EGFP組得到改善。(5)與Sham組相比，IR組心肌組織炎癥因子IFN-β和TN

5、F-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；Ad-RP105組的IFN-β和TNF-α的表達(dá)水平較IR組或Ad-EGFP組明顯下降(P<0.05)。(6)與Sham組相比，IR組TLR4/TRIF信號通路相關(guān)蛋白TRIF、TBK-1、IRF3、p-IRF3的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；Ad-RP105組上述蛋白表達(dá)水平較IR組或Ad-EGFP組明顯下調(diào)(P<0.05)。(7)與Sham組相比，IR組TLR4/TRIF信號通路相關(guān)基因TR

6、IF、TBK-1、IRF3的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；Ad-RP105組上述基因表達(dá)水平較與IR組或Ad-EGFP組明顯下調(diào)(P<0.05)。(8)心肌缺血再灌注處理顯著增加核轉(zhuǎn)錄因子IRF3的DNA結(jié)合活性，RP105對IRF3的DNA結(jié)合活性有一定的抑制作用。
　　結(jié)論：(1) TLR4/TRIF/IRF3信號通路在MIRI的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的推動作用，參與缺血再灌注心肌細(xì)胞的炎癥損傷過程。(2)通過腺病毒感染的方式使