活性氧對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的：建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型及體外大鼠心肌細胞缺氧復氧損傷模型，利用Annexin V-FITC/PI雙染法、免疫組化法、FCM法、MTT法及Westernblot法分別檢測細胞凋亡、細胞增殖活性、及信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)磷酸化水平，觀察活性氧簇(ROS)在缺血再灌注損傷心肌保護機制中的作用，并探討ROS對心肌細胞中酪氨酸激酶2-信號傳導與轉錄激活因子3(JAK2-STAT3)通路的影響。
　　方法：1、將

2、32只實驗大鼠(體質量240～280g)隨機分為4組，每組8只大鼠：(1)空白對照組(Sham組)：開胸后將6/0無損傷縫線穿過左冠狀動脈前降支，并不阻斷血管。(2)缺血再灌注損傷組(I/R組)：使用6/0無損傷縫線阻斷左冠狀動脈30min后，開放血管。(3)缺血后處理組(PostC組)：缺血30min后，立即進行缺血后處理(開放10s隨后再阻斷10s，反復3次)。(4)缺血后處理+MPG組(PostC+MPG組)：再灌注前5min靜脈

3、注射自由基清除劑MPG(20mg/kg)。其余處理同缺血后處理組。腹腔注射10％水合氯醛(3 mg/g)，大鼠四肢接心電圖監(jiān)護電極。分離右側頸總動脈安置動脈測壓管；分離并切開氣管，連接小動物呼吸機，氣源為室內空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量13～15ml。左側第4肋間開胸，使用6/0無損傷縫線，穿過左冠狀動脈前降支并阻斷血管。心電監(jiān)護顯示ST段顯著抬高表明冠脈阻斷成功。阻斷30min后，松開縫線使血管再通，心電監(jiān)護顯示ST段回落。隨

4、機選取8只實驗大鼠于再灌注10min取心肌標本，用于檢測JAK2-STAT3通路活性；隨機選取8只實驗大鼠于再灌注2h取心肌標本，使用心肌細胞凋亡試劑盒檢測心肌細胞凋亡、免疫組織化學法檢測心肌組織中bcl-2及bcl-xL蛋白水平、Western blot法檢測磷酸化STAT3(p-STAT3)及總STAT3(t-STAT3)水平。2、大鼠心肌細胞(H9C2)經體外培養(yǎng)擴增，使用對數(shù)生長期細胞做實驗處理。預實驗部分分別使用濃度為0、5、

5、10、20、50、100μmol/LH2O2處理H9C2細胞，以確定最佳H2O2預處理濃度。觀察低濃度H2O2預處理對缺氧/復氧所引起細胞損傷的影響。確定最佳預處理濃度后實驗部分將細胞分為四組(1)對照組：常規(guī)培養(yǎng)。(2)缺氧/復氧組：預先在5％CO2，95％N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 min，復氧30 min。(3)H2O2預處理組：預先給予確定濃度的H2O2處理90 min換液，24 h后重復缺氧/復氧處理。(4)JAK2-STAT3阻

6、斷劑(AG490)+H2O2組：在H2O2預處理前10 min給予10μmol/LAG490處理，余處理同H2O2預處理組。處理完成后分別使用AnnexinV-FITC/PI雙染法及FCM法檢測細胞凋亡；MTT法檢測H9C2細胞增殖活性；Western blot法檢測信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3)磷酸化水平。
　　結果：1、缺血后處理抗凋亡作用：假手術組心肌組織中可見微量bcl一2及bcl-xL蛋白表達，未見明顯心肌細胞凋

7、亡；缺血再灌注損傷組bcl-2及bcl-xL蛋白水平均明顯升高，可見大量心肌細胞凋亡。缺血后處理顯著上調bcl-2(42.4±5.6比8.6+2.4，P<0.05)及bel-xL(19.9±3.2比9.6±2.5，P<0.05)蛋白水平，并抑制再灌注后心肌細胞凋亡(37.8±4.0比56.9±6.0，P<0.05)。
　　2、MPG(自由基清除劑)對缺血后處理抗凋亡作用影響：缺血后處理前使用自由基清除劑MPG可使再灌注后心肌組織b

8、cl一2(10.5±2.1比42.4±5.6，P<0.05)及bcl-xL(9.9±2.3比19.9±3.2，P<0.05)蛋白水平顯著降低，并顯著升高再灌注后心肌細胞凋亡比率(55.7±7.7比37.8±4.0，P<0.05)。
　　3、MPG對JAK2-STAT3通路影響：缺血后處理顯著上調再灌注后STAT3磷酸化水平(0.27±0.02比0.43±0.08，P<0.05)。再灌注前使用MPG顯著降低缺血后處理后P-STAT3

9、水平(0.27±0.04比0.43±0.08，P<0.05)，抑制JAK2-STAT3通路活性。
　　4、不同濃度H2O2預處理對H9C2細胞的影響：與其他各濃度組相比，20μmol/L組的STAT3磷酸化水平顯著升高；201μmol/L組與501μmol/L及100μmol/L組相比，心肌細胞凋亡率明顯降低(16.63±3.65比37.45±4.82和45.52±4.14，P<0.05)；20μmol/L組的心肌細胞活力及細胞凋

10、亡率與5及10μmol/L組差異無統(tǒng)計學意義。
　　5、20μmol/L H2O2預處理對心肌細胞凋亡率、細胞活力及對STAT3磷酸化水平的影響：缺氧/復氧組較對照組凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意(47.71±4.74比6.22±1.72，P<0.01)；H2O2預處理組凋亡率較缺氧/復氧組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(27.25±3.06比47.71±4.74，P<0.01)；缺氧/復氧組和AG490組之間細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意

11、義。缺氧/復氧組和AG490+H2O2組心肌細胞活力較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；H2O2預處理組心肌細胞活力較缺氧/復氧組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(76.51±4.36比46.32±5.62，P<0.01)。結果顯示Ht2O2預處理可顯著增高STAT3磷酸化水平；AG490+H2O2組的STAT3磷酸化水平明顯低于單純H2O2預處理組。
　　結論：1、氧化還原信號通路在缺血后處理抗心肌細胞凋亡機制中發(fā)揮重