活性氧對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型及體外大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，利用Annexin V-FITC/PI雙染法、免疫組化法、FCM法、MTT法及Westernblot法分別檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖活性、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)磷酸化水平，觀察活性氧簇(ROS)在缺血再灌注損傷心肌保護(hù)機(jī)制中的作用，并探討ROS對(duì)心肌細(xì)胞中酪氨酸激酶2-信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2-STAT3)通路的影響。
　　方法：1、將

2、32只實(shí)驗(yàn)大鼠(體質(zhì)量240～280g)隨機(jī)分為4組，每組8只大鼠：(1)空白對(duì)照組(Sham組)：開胸后將6/0無損傷縫線穿過左冠狀動(dòng)脈前降支，并不阻斷血管。(2)缺血再灌注損傷組(I/R組)：使用6/0無損傷縫線阻斷左冠狀動(dòng)脈30min后，開放血管。(3)缺血后處理組(PostC組)：缺血30min后，立即進(jìn)行缺血后處理(開放10s隨后再阻斷10s，反復(fù)3次)。(4)缺血后處理+MPG組(PostC+MPG組)：再灌注前5min靜脈

3、注射自由基清除劑MPG(20mg/kg)。其余處理同缺血后處理組。腹腔注射10％水合氯醛(3 mg/g)，大鼠四肢接心電圖監(jiān)護(hù)電極。分離右側(cè)頸總動(dòng)脈安置動(dòng)脈測壓管；分離并切開氣管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，氣源為室內(nèi)空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量13～15ml。左側(cè)第4肋間開胸，使用6/0無損傷縫線，穿過左冠狀動(dòng)脈前降支并阻斷血管。心電監(jiān)護(hù)顯示ST段顯著抬高表明冠脈阻斷成功。阻斷30min后，松開縫線使血管再通，心電監(jiān)護(hù)顯示ST段回落。隨

4、機(jī)選取8只實(shí)驗(yàn)大鼠于再灌注10min取心肌標(biāo)本，用于檢測JAK2-STAT3通路活性；隨機(jī)選取8只實(shí)驗(yàn)大鼠于再灌注2h取心肌標(biāo)本，使用心肌細(xì)胞凋亡試劑盒檢測心肌細(xì)胞凋亡、免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織中bcl-2及bcl-xL蛋白水平、Western blot法檢測磷酸化STAT3(p-STAT3)及總STAT3(t-STAT3)水平。2、大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增，使用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)處理。預(yù)實(shí)驗(yàn)部分分別使用濃度為0、5、

5、10、20、50、100μmol/LH2O2處理H9C2細(xì)胞，以確定最佳H2O2預(yù)處理濃度。觀察低濃度H2O2預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧所引起細(xì)胞損傷的影響。確定最佳預(yù)處理濃度后實(shí)驗(yàn)部分將細(xì)胞分為四組(1)對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)。(2)缺氧/復(fù)氧組：預(yù)先在5％CO2，95％N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 min，復(fù)氧30 min。(3)H2O2預(yù)處理組：預(yù)先給予確定濃度的H2O2處理90 min換液，24 h后重復(fù)缺氧/復(fù)氧處理。(4)JAK2-STAT3阻

6、斷劑(AG490)+H2O2組：在H2O2預(yù)處理前10 min給予10μmol/LAG490處理，余處理同H2O2預(yù)處理組。處理完成后分別使用AnnexinV-FITC/PI雙染法及FCM法檢測細(xì)胞凋亡；MTT法檢測H9C2細(xì)胞增殖活性；Western blot法檢測信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)磷酸化水平。
　　結(jié)果：1、缺血后處理抗凋亡作用：假手術(shù)組心肌組織中可見微量bcl一2及bcl-xL蛋白表達(dá)，未見明顯心肌細(xì)胞凋

7、亡；缺血再灌注損傷組bcl-2及bcl-xL蛋白水平均明顯升高，可見大量心肌細(xì)胞凋亡。缺血后處理顯著上調(diào)bcl-2(42.4±5.6比8.6+2.4，P<0.05)及bel-xL(19.9±3.2比9.6±2.5，P<0.05)蛋白水平，并抑制再灌注后心肌細(xì)胞凋亡(37.8±4.0比56.9±6.0，P<0.05)。
　　2、MPG(自由基清除劑)對(duì)缺血后處理抗凋亡作用影響：缺血后處理前使用自由基清除劑MPG可使再灌注后心肌組織b

8、cl一2(10.5±2.1比42.4±5.6，P<0.05)及bcl-xL(9.9±2.3比19.9±3.2，P<0.05)蛋白水平顯著降低，并顯著升高再灌注后心肌細(xì)胞凋亡比率(55.7±7.7比37.8±4.0，P<0.05)。
　　3、MPG對(duì)JAK2-STAT3通路影響：缺血后處理顯著上調(diào)再灌注后STAT3磷酸化水平(0.27±0.02比0.43±0.08，P<0.05)。再灌注前使用MPG顯著降低缺血后處理后P-STAT3

9、水平(0.27±0.04比0.43±0.08，P<0.05)，抑制JAK2-STAT3通路活性。
　　4、不同濃度H2O2預(yù)處理對(duì)H9C2細(xì)胞的影響：與其他各濃度組相比，20μmol/L組的STAT3磷酸化水平顯著升高；201μmol/L組與501μmol/L及100μmol/L組相比，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(16.63±3.65比37.45±4.82和45.52±4.14，P<0.05)；20μmol/L組的心肌細(xì)胞活力及細(xì)胞凋

10、亡率與5及10μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、20μmol/L H2O2預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及對(duì)STAT3磷酸化水平的影響：缺氧/復(fù)氧組較對(duì)照組凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(47.71±4.74比6.22±1.72，P<0.01)；H2O2預(yù)處理組凋亡率較缺氧/復(fù)氧組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(27.25±3.06比47.71±4.74，P<0.01)；缺氧/復(fù)氧組和AG490組之間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義。缺氧/復(fù)氧組和AG490+H2O2組心肌細(xì)胞活力較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；H2O2預(yù)處理組心肌細(xì)胞活力較缺氧/復(fù)氧組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(76.51±4.36比46.32±5.62，P<0.01)。結(jié)果顯示Ht2O2預(yù)處理可顯著增高STAT3磷酸化水平；AG490+H2O2組的STAT3磷酸化水平明顯低于單純H2O2預(yù)處理組。
　　結(jié)論：1、氧化還原信號(hào)通路在缺血后處理抗心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮重