靶向于IL15受體的人源化重組毒素的研究.pdf

1、目的:一些惡性腫瘤如成人T淋巴細(xì)胞性白血病和骨髓瘤細(xì)胞表面含有豐富的IL15受體(IL15R),炎癥性自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏病等也都發(fā)現(xiàn)活化的IL15R陽性T淋巴細(xì)胞的浸潤和聚集.IL15及IL15R陽性細(xì)胞在這些疾病的病理過程中起著重要作用.該項目應(yīng)用基因重組技術(shù),以人IL15(hIL15)或受體拈抗型IL15突變體(hIL15M)為載體,人腫瘤壞死因子突變體TNF<,a>M為彈頭,構(gòu)建、表達(dá)兩種具有低免

2、疫原性、低TNF<,a>全身性毒副作用的融合毒素,為研制特異的可消除IL15受體高表達(dá)細(xì)胞的導(dǎo)向藥物奠定基礎(chǔ).方法:通過RT-PCR從人胎盤組織中克隆出hL15成熟肽cDNA,并進一步刪去5′端前8個氨基酸殘基的編碼序列獲得對靶細(xì)胞不具有激動作用的人白介素15突變體(hIL15M)基因,將hIL15成熟肽基因、hL15M基因片段分別與人工改造的TNF<,a>M基因按正確的閱讀框架融合,定向克隆于pET16b表達(dá)載體,得到重組質(zhì)粒pET-

3、hIL15-TNF<,a>M(pITM)和pET-hIL15M-TNF<,a>M(pIMTM).經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),Ni-NTA親和層析純化出兩種融合蛋白,即hIL15/TNF<,a>M和hIL15M/TNF<,a>M.MTT法測定兩種融合蛋白對IL15R陽性人紅白血病細(xì)胞K562的細(xì)胞毒作用.結(jié)果:經(jīng)酶切分析和DNA序列分析,所構(gòu)建的兩個重組質(zhì)粒均正確插入了各自的融合基因.SDS-PAGE分析表明,上述兩種重組菌株誘導(dǎo)后分別表達(dá)與融合

4、蛋白hIL15/TNFaM和hIL15M/TNF<,a>M預(yù)計分子量相吻合的特異性蛋白帶.融合蛋白hIL15/TNF<,a>M以不溶性包涵體存在.在變性條件下從大腸桿菌中純化出兩種融合蛋白,以半數(shù)殺傷濃度(IC<,50>)為指標(biāo),復(fù)性后融合蛋白hIL15/TNF<,a>M和hIL15M/TNF<,a>M對K562的殺傷作用分別是rhTNF<,a>的4和15倍.結(jié)論:(1)融合蛋白hIL15/TNF<,a>M和hIL15M/TNF<,a>

5、M對K562的殺傷作用強于rhTNF<,a>,說明兩種融合蛋白均可以靶向高表達(dá)hIL15R的細(xì)胞,增強TNF<,a>局部的細(xì)胞毒作用,對活化T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性自身免疫性疾病或高表達(dá)IL15R的惡性腫瘤具有潛在的治療價值.(2)融合蛋白hIL15M/TNF<,a>M對K562的殺傷作用是融合蛋白hIL15/TNF<,a>M的4倍,提示對靶細(xì)胞不具有激動效應(yīng)的IL15受體拮抗劑hIL15M是細(xì)胞毒藥物更為理想的載體,融合蛋白hIL15M/T