靶向于白細(xì)胞介素15受體的融合毒素研究.pdf

1、目的:一些惡性腫瘤如成人T淋巴細(xì)胞性白血病和骨髓瘤細(xì)胞表面含有豐富的白介素15受體(IL-15R),炎癥性自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏病等也都發(fā)現(xiàn)活化的IL-15R陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)和聚集.IL-15及IL-15R陽(yáng)性細(xì)胞在這些疾病的病理過(guò)程中起著重要作用.本項(xiàng)目應(yīng)用基因重組技術(shù),以人白介素15(hIL-15)或受體拮抗型人白介素15突變體(hIL-15M)為載體,綠膿桿菌外毒素突變體PE△293為彈頭,構(gòu)建、

2、表達(dá)兩種融合毒素,為研制可特異性消除IL-15R高表達(dá)細(xì)胞的導(dǎo)向藥物奠定基礎(chǔ).方法:通過(guò)PCR對(duì)綠膿桿菌外毒素進(jìn)行人工改造,獲得一種新的綠膿桿菌外毒素突變體,PE△293.將hIL-15成熟肽基因、hIL-15M基因片段分別與PE△293基因按正確的閱讀框架融合,定向克隆于pET16b表達(dá)載體,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-hIL-15-PE△293和pET-hIL-15M-PE△293.將這兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pl

3、ysS,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),變性條件下通過(guò)Ni<'2+>-NTA親和層析純化出兩種融合蛋白,即hIL-15-PE△293和hIL-15M-PE△293.復(fù)性后MTT法測(cè)定兩種融合蛋白對(duì)IL-15R陽(yáng)性人紅白血病細(xì)胞K562和其阿霉素耐藥株K562/AO<,2>以及IL-15R陰性的急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat的細(xì)胞毒作用.結(jié)果:經(jīng)酶切分析和DNA序列分析,所構(gòu)建的兩個(gè)重組質(zhì)粒均正確插入了各自的融合基因.SDS-PAGE分析表明,兩

4、種重組菌株誘導(dǎo)后分別表達(dá)與融合蛋白預(yù)計(jì)分子量相吻合的特異性蛋白帶.在變性條件下從大腸桿菌中純化出兩種融合蛋白,復(fù)性后兩種融合蛋白對(duì)IL-15R陽(yáng)性細(xì)胞株K562和K562/AO<,2>具有明顯的殺傷活性,但是對(duì)IL-15R陰性細(xì)胞株Jurkat沒(méi)有表現(xiàn)明顯的殺傷作用.結(jié)論:(1)融合蛋白hIL-15-PE△293和hIL-15M-PE△293對(duì)K562和K562/AO<,2>具有良好的殺傷活性,而對(duì)IL-15R陰性細(xì)胞株Jurkat沒(méi)有