蜘蛛毒素作用受體的分離與鑒定.pdf

1、自然界的天然毒素是人類可以利用的寶貴資源。目前，自然界的動(dòng)物毒素尤其是蜘蛛毒素已引起相關(guān)科學(xué)工作者濃厚興趣。蜘蛛毒素種類繁多、功能多樣，在神經(jīng)生物學(xué)和藥理學(xué)等方面具有重要的應(yīng)用前景。近年來，對(duì)蜘蛛毒素的研究取得了重大進(jìn)展，用電壓鉗和膜片鉗等電生理技術(shù)對(duì)許多作用于細(xì)胞膜上的電壓門控離子通道如鉀、鈉、鈣離子通道的毒素的性質(zhì)進(jìn)行了分析。這些技術(shù)已成為研究毒素作用機(jī)理的主要方法。但電壓鉗和膜片鉗技術(shù)用于鑒定毒素的結(jié)合蛋白質(zhì)時(shí)具有一定的局限性，因

2、為它們往往是定向的使用不同類型的離子通道或其亞型去探測(cè)蜘蛛毒素的活性。在本研究中，我們選取一種具有代表性的蜘蛛神經(jīng)毒素虎紋捕鳥蛛毒素-I(HWTX-I)為材料，采用基于生物素標(biāo)記的策略，通過檢測(cè)和鑒定HWTX-I在神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上的結(jié)合蛋白(泛稱受體)的方法探討HWTX-I的功能，從而獲得關(guān)于HWTX-I作用機(jī)理的更直接的信息。
　　 HWTX-I是從虎紋捕鳥蛛粗毒中分離純化出的一種分子量為3.75 kDa的多肽神經(jīng)毒素。它由33

3、個(gè)氨基酸殘基組成，含3對(duì)二硫鍵。電生理實(shí)驗(yàn)表明它能可逆性阻斷小鼠膈神經(jīng)-膈肌標(biāo)本的神經(jīng)肌肉接頭傳遞。為了檢測(cè)它在膈神經(jīng)-膈肌的神經(jīng)肌肉接頭中的受體，本文利用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin對(duì)純化的HWTX-I進(jìn)行標(biāo)記，再利用生物素化的HWTX-I(biotin-HWTX-I)與富含神經(jīng)肌肉接頭的大鼠膈肌細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)作用。通過兩種方式分離和鑒定與biotin-HWTX-I結(jié)合的蛋白質(zhì)。一種是用biotin-HWTX-I與

4、制備的質(zhì)膜碎片孵育再用交聯(lián)劑BS3進(jìn)行交聯(lián)，然后用含去污劑的緩沖液提取蛋白質(zhì)并用SDS-PAGE進(jìn)行分離。凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上后用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(HRP-avidin)檢測(cè)和顯影。另一種方法是先將大鼠膈肌細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)提取并進(jìn)行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后對(duì)PVDF膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性處理，再與biotin-HWTX-I進(jìn)行孵育，最后用HRP-avidin檢測(cè)和顯影。對(duì)兩種方法中顯現(xiàn)的條帶的蛋白質(zhì)用

5、CapLC-MS/MS進(jìn)行分析鑒定。
　　 生物質(zhì)譜和電生理技術(shù)證明本研究中制備的biotin-HWTX-I為標(biāo)記上一個(gè)生物素基團(tuán)的修飾產(chǎn)物，生物素標(biāo)記未影響其生物學(xué)活性。在分析結(jié)合蛋白的第一種方法中，利用HRP-avidin在PVDF膜上大約72 kDa，的位置顯示出條帶，提示該條帶很可能含有HWTX-I的結(jié)合蛋白。為了檢測(cè)蛋白質(zhì)中是否含有內(nèi)源性抗生物素蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，我們利用未標(biāo)記的HWTX-I以及不用HWTX-I的空白對(duì)照

6、進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明兩種情況下都在相同的位置有條帶顯現(xiàn)，且未標(biāo)記HWTX-I存在時(shí)的條帶顏色比不用HWTX-I時(shí)的條帶顏色淺。這說明質(zhì)膜蛋白質(zhì)本身具有內(nèi)源性抗生物素蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而且抗生物素蛋白的結(jié)合位點(diǎn)很可能與HWTX-I的相同或大部分重疊。在分析HWTX-I受體的另一種方法中，膜蛋白被提取、SDS-PAGE分離和轉(zhuǎn)至PVDF膜上后才用biotin-HWTX-I進(jìn)行檢測(cè)。為了研究蛋白質(zhì)復(fù)性處理對(duì)HWTX-I與蛋白結(jié)合的影響，對(duì)HWTX

7、-I與膜上蛋白質(zhì)復(fù)性處理前后的結(jié)合差異進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，對(duì)膜上蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)性處理后HWTX-I與蛋白質(zhì)的結(jié)合增強(qiáng)。與此同時(shí)，我們還利用HRP-avidin在不同實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)PVDF膜上的蛋白質(zhì)或biotin-HWTX-I，高濃度的抗生物素蛋白并不能完全阻斷HWTX-I與潛在的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合(反之亦然)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了avidin和HWTX-I在結(jié)合蛋白質(zhì)中的結(jié)合位點(diǎn)并不完全重疊。
　　 將HRP-avidin顯現(xiàn)的條帶中的