虎紋捕鳥蛛毒素組學分析與幾種蜘蛛多肽毒素的結構功能關系研究.pdf

1、虎紋捕鳥蛛(Ornithoctonus huwena Wang)是中國南方發(fā)現(xiàn)的一種具有很強毒性的蜘蛛新種。本實驗室前面的研究中已經從中鑒定到十多種具有不同生物學活性的毒素組分。本文通過蛋白質組分析方法結合多維色譜技術對虎紋捕鳥蛛粗毒進行了一個系統(tǒng)的、全面的毒素組學分析。粗毒通過分子篩被分為兩個部分：分子量10kDa以上的蛋白質和分子量10kDa以下的多肽組分。對分子量10kDa以上的蛋白質，利用2-DE分離，PDQUEST軟件分析，發(fā)

2、現(xiàn)了大約300個蛋白質點；同時我們對這些組分也進行1DE分離。對所有1DE條帶和2DE膠上的蛋白質點進行酶解，質譜(MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF)鑒定，一共準確鑒定到90種蛋白質，包括一些具有重要生物學意義的酶、結合蛋白質和調控蛋白質等。通過陽離子交換和反相高效液相色譜柱層析(HPLC)對10kDa以下的多肽組分進一步純化，MALDI-TOF質譜鑒定到133種組分，并利用Edman降解技術得到了其中47種多肽序列，這些

3、多肽序列與其它動物毒液中的多肽序列相似性很低，并且表現(xiàn)出結構和功能的多樣性，這也表明了虎紋捕鳥蛛毒液的獨特性。進化分析表明這些多肽可以分為幾個超家族，并且在進化過程中發(fā)生了基因復制和定點突變。 Huwentoxin-Ⅺ(HWTX-Ⅺ)是從虎紋捕鳥蛛粗毒中純化得到的一種雙功能多肽毒素，兼有絲氨酸蛋白酶抑制活性和鉀離子通道阻斷活性。MALDI-TOF質譜鑒定和Edman降解測序結果表明：HWTX-Ⅺ由55個氨基酸殘基組成，分子量為

4、6166.2Da。三維結構解析表明HWTX-Ⅺ屬于Kunitz蛋白家族，六個半胱氨酸以1-6、2-4、3-5的方式形成三對二硫鍵。通過表面等離子共振技術測得HWTX-Ⅺ與胰蛋白酶的解離常數為<1×10<'12> M，與胰凝乳蛋白酶的解離常數為1.56×10<'-7> M；利用等溫滴定量熱法準確測定HWTX-Ⅺ與胰蛋白酶的解離常數為8.92×10<'12> M。HWTX-Ⅺ對DRG細胞上的鈣通道和鈉通道沒有作用，但能夠抑制DRG上的外向延

5、遲整流鉀電流。電壓鉗實驗進一步證明HWTX-Ⅺ能夠抑制表達在爪蟾卵母細胞上的Kv1.1電流，半抑制濃度為2.57 μ M，對Kv1.2和Kv1.3電流也有比較弱的抑制作用，這種抑制具有電壓依賴性。我們采用RACE的方法獲得了HWTX-Ⅺ的cDNA序列，根據結構解析的結果在可能的活性區(qū)域設計了18個突變體，并使用載體pVT102U實現(xiàn)了在釀酒酵母中的表達。其中Lys14突變?yōu)锳1a后HWTX-Ⅺ沒有表現(xiàn)出胰蛋白酶抑制活性，突變體S16R、

6、R12P和G36R的酶抑制活性下降1～3倍，而突變體R10T的酶抑制活性上升了大約6倍，這些結果表明Lys14是HWTX-Ⅺ的關鍵活性殘基，臨近的幾個殘基是胰蛋白酶抑制活性的重要殘基，這些殘基突變不影響HWTX-Ⅺ的鉀通道活性。HWTX-Ⅺ的鉀通道活性區(qū)域在N-端和β-轉角區(qū)，突變體L6Y、L6A使HWTX-Ⅺ的鉀通道活性幾乎完全喪失，Arg5和Arg25突變?yōu)锳1a使毒素的通道活性分別下降了14倍和4倍；T3L、T3Y、G24W和G2

7、4Q的突變使毒素活性下降2～10倍，這部分殘基的突變不影響它們的蛋白酶抑制活性，證明這兩個功能區(qū)域是完全獨立的。HWTX-Ⅺ的研究為Kunitz超家族多肽毒素的進化提供了非常有價值的線索。敬釗纓毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是最近在我國海南省發(fā)現(xiàn)的一種蜘蛛新種。結合陽離子交換和反相HPLC的方法，我們從其粗毒中純化到三種新的毒素多肽，并命名為敬釗纓毛蛛毒素-Ⅺ(JZTX-Ⅺ)、敬釗纓毛蛛毒素-Ⅻ(JZTX-Ⅻ)和敬釗

8、纓毛蛛毒素-ⅩⅢ(JZTX-ⅩⅢ)。MALDI-TOF質譜鑒定和Edman降解測序結果表明：JZTX-Ⅺ、JZTX-Ⅻ和JZTX-ⅩⅢ都是單鏈多肽分子，分子量分別為3726.38、3665.4和4122.5 Da，由34、29和35個氨基酸殘基組成，6個Cys形成三對二硫鍵。利用雙電極桿電壓鉗技術我們鑒定了這三種毒素及其它三種敬釗纓毛蛛毒素(敬釗纓毛蛛毒素-Ⅰ(JZTX-Ⅰ)、敬釗纓毛蛛毒素-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)和敬釗纓毛蛛毒素-Ⅴ(JZ

9、TX-Ⅴ))對鉀離子通道的影響特征。電壓鉗結果表明這六種毒素都以調制通道門控特征的方式作用于Kv2和Kv4通道，但對這兩種通道家族表現(xiàn)出不同的親和力和通道亞型的不同選擇性。JZTX-Ⅺ和JZTX-Ⅲ是Kv2通道抑制劑，JZTX-Ⅴ和JZTX-Ⅻ屬于Kv4通道毒素，對Kv2.01表現(xiàn)出比較弱的抑制作用，但JZTX-Ⅰ和JZTX-ⅩⅢ表現(xiàn)出同等程度的Kv2和Kv4通道親和力。這些毒素的結構-功能關系研究表明，毒素分子表面活性區(qū)域的電荷分布差

10、異導致的靜電各向異性是毒素對離子通道不同選擇性的關鍵因素。抑制動力學結果表明，在半有效量的毒素濃度下，它們的抑制動力學有很大的差別。JZTX-Ⅴ表現(xiàn)出最快的抑制速度(抑制常數為τ≈9.5 s)，這種抑制是可逆的，把毒素洗脫掉以后，電流以非?？斓乃俣然謴偷綄φ账?時間常數為15 s)，另外五種毒素都表現(xiàn)出通道毒素的慢抑制動力學特征。針對這六種毒素的不同離子通道選擇性和動力學特征，我們進行了進化方面的分析，結果表明這六個毒素在進化樹上分別