生物科學(xué)畢業(yè)論文黃?？舅氐姆蛛x純化與鑒定

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　黃?？舅氐姆蛛x純化與鑒定</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物科學(xué)

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></

3、p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1 材料與方法3</b></p><p><b>　　1.1材料3</b>

4、;</p><p>　　1.1.1實驗材料3</p><p>　　1.1.2實驗儀器3</p><p>　　1.1.3實驗試劑3</p><p><b>　　1.2方法3</b></p><p>　　1.2.1?？侄镜奶崛?</p><p>　　1.2.2?？?/p>

5、素的分離4</p><p>　　1.2.3 毒素多肽的用Tris-Tricine SDS-PAGE電泳7</p><p>　　1.2.4通過質(zhì)譜分析對毒素多肽進行初步的鑒定9</p><p><b>　　2 實驗結(jié)果10</b></p><p>　　2.1?？舅亟?jīng)Sepax-100A色譜柱第一次分離10<

6、;/p><p>　　2.2 海葵毒素經(jīng)C8半制備型反相HPLC第二次分離11</p><p>　　2.3?？舅亟?jīng)分析型C18反相柱第三次分離13</p><p>　　2.4對分離后的?？舅刭|(zhì)譜分析14</p><p><b>　　討論16</b></p><p><b>　　參考

7、文獻18</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要]：黃?？ˋnthopLeura xanthogrammica）是舟山海域中常見的一種小型海葵，其身體以及觸手中都含有刺細胞，刺細胞中含有海葵毒素[1]。?？亲饔糜陔x子通道的縮氨酸毒素的豐富來源，

8、兩類縮氨酸毒素：一類是site-3鈉通道毒素；另一類是Kv1鉀通道毒素，其特性已被很好的表現(xiàn)，它們中的一部分被用于有價值的藥理學(xué)試劑[2]。由于海葵種類繁多、分布較廣，使得很多海葵毒素未得到研究，極大一部分的?？舅氐慕Y(jié)構(gòu)與功能都尚不清楚。我們本實驗通過反復(fù)凍融提取?？侄?，并利用多維高效液相色譜對?？舅剡M行分離，同時在動物體上進行殺蟲活性分析等方法，從黃?？侄局泻Y選出七種具有較強殺蟲活性的殺蟲肽。這七種多肽在100μg/kg體重濃

9、度下對水白蝦以及黃粉蟲幼蟲都具有強且快速的麻痹及很強的致死活性，但其多肽在相同體重濃度下的相對于小白鼠而言毒性作用很弱。通過質(zhì)譜分析，得到的七種殺蟲多肽的分子量約在2~5kDa之間，其中分子量為5018kDa的殺蟲多肽質(zhì)譜得到的氨基酸序列為GGVPCLCDSDGPSVRGNTLSGIIWLRGCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQ。上述研究結(jié)果表明</p><p>　　[關(guān)鍵詞]：黃?？?；海葵毒素；殺蟲肽；高

10、效液相色譜；質(zhì)譜分析；</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract]: AnthopLeura xanthogrammica is a commonly small sea anemones in zhoushan waters. its body and tentacles contain the stinging

11、cell .it contains the sea anemone toxins [1]. The sea anemone is the resource of peptide toxins which work in ion channel. two kinds of peptide toxins: one kind is site - 3 sodium channel toxins; Another kind is Kv1 pota

12、ssium channel toxins, its character has been perfectly performed. Which of them could be as to valuable pharmacological reagents[2]. Because of </p><p>　　[Keyword] AnthopLeura xanthogrammica; sea anemone tox

13、ins; Insecticidal peptide; High performance liquid chromatography (HPLC); Mass spectrometry</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　節(jié)肢動物害蟲分布于世界的各個角落，破壞了世界上20-40%的農(nóng)作物[3]。多年來，我國農(nóng)業(yè)害蟲的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，不僅造

14、成環(huán)境污染，而且引發(fā)害蟲產(chǎn)生抗藥性和農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標等嚴重問題。如今世界許多國家從蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒、海洋和植物等天然生物資源中篩分和鑒定各種有效生理活性成分，并利用這些天然神經(jīng)生物毒素構(gòu)建新型的生物殺蟲劑和抗病蟲害植物體系。其中，海葵毒素由于其主要作用對象為甲殼類動物因而在生物毒素來源的殺蟲劑開發(fā)中受到重視。</p><p>　　?？置＞栈ā⒑５砀瑢儆谇荒c動物門（又名刺細胞動物門），珊瑚蟲綱、六放珊瑚亞

15、綱海洋獨居動物，六放珊瑚亞綱下有3 個目, 包括?？俊⑷后w海葵目和角?？縖5]。?？挠|手及身體均含有大量的刺細胞,通過刺細胞，分泌毒液捕食魚、貝類、橈足類、甲殼類動物等。當?？艿酵饨鐧C械或化學(xué)刺激時, 會釋放刺絲刺入獵物身體并將毒素注入獵物體內(nèi), 以此達到捕食或防御的目的。海葵種類繁多,目前有報道的已超過1 000 種, 廣泛分布于世界各海區(qū), 中國?？贩N約占世界的1/10。</p><p>　　對?？?/p>

16、毒素多肽的研究自20世紀70年代開始，目前已經(jīng)從約40 種海葵中分離到超過300種毒素多肽分子，包括Nav通道，鉀離子通道毒素，酸感受離子通道，穿孔素，蛋白酶抑制劑等。根據(jù)分子量以及生物學(xué)功能的不同, 可以分為?？芗毎舅匾约昂？嚯念惿窠?jīng)毒素兩大類[6]。?？舅刂杂绊戨妷洪T離子通道，是因為其作用對象無論是脊椎還是無脊椎動物，大部分都通過動作電位完成信號傳導(dǎo)的。有一些?？麑θ硕际呛芪ｋU的，但大多數(shù)情況下，只是發(fā)炎或輕微疼痛。Ac

17、tinoporins對魚和甲殼動物這類天然食物毒性非常高，即使是釋放在水中，毒性也相當高。</p><p>　　?？浲ǖ蓝舅匾延惺喾N被分離到，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)的不同可將其分為三類，分別為1型，2型和3型。1型鉀通道毒素主要包括來自列指?？腟hK[8]、溝迎風?？腁sKS[9]、?？腂gK[10]、公主?？腍mK[11]、Actinia equina的AeK[12]等。最近又從?？蟹蛛x到一種新的1型鉀通

18、道毒素，命名為AETX K，這是目前發(fā)現(xiàn)的第六種1型鉀通道毒素[13]。1型鉀通道毒素由35-37個氨基酸殘基組成，序列中含六個半胱氨酸并形成3對二硫鍵，其連接方式不同于海葵鈉通道毒素，為I-VI，II-IV和III-V。?？?型鉀通道毒素主要作用于Kv1鉀通道并阻斷鉀離子電流，且對Kv1鉀通道的阻斷作用非常強烈，例如，Kv1.1和Kv1.3鉀通道的半抑制濃度達皮摩爾水平，是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強的Kv1鉀通道毒素之一，這對于Kv1鉀通道及

19、其相關(guān)疾病的研究具有重要意義[14]。此外，還被發(fā)現(xiàn)能強烈抑制Kv3.2鉀通道電流，其IC50為0.6 nM[15]。?？?型鉀通道毒素目前發(fā)現(xiàn)得還不多，從溝迎風海葵Anemonia sulcata中分離到三種鉀通道毒素，命名為AsKC-1，2和3，這三種</p><p>　　從?？羞€發(fā)現(xiàn)不少多肽毒素對甲殼類動物具有特異的致死或麻痹作用，而對哺乳動物沒有活性，該類多肽毒素的作用靶點尚不清楚，但其對甲殼動物所表現(xiàn)

20、出的選擇性毒理作用使其有望成為開發(fā)殺蟲肽的先導(dǎo)分子[20]。例如，來自?？腁ETX II和III[21],來自海葵的gigantoxin I [22,23], 以及來自?？腁m I和II等[24]。上述海葵毒素均能特異地作用于甲殼動物，使其麻痹或死亡，而對哺乳動物沒有毒性。</p><p>　　?？舅刂杂绊戨妷洪T離子通道，是因為其作用對象無論是脊椎還是無脊椎動物，大部分都通過動作電位完成信號傳導(dǎo)的。從進

21、化的角度看，?？募讱游锾禺愋远舅匾苍S可以讓我們發(fā)掘到一些昆蟲特異性毒素。鑒于節(jié)肢動物與甲殼動物存在進化同源性，?？舅囟嚯膶ハx也具有毒害作用，其中有很多是對昆蟲有特異殺傷作用而對哺乳動物低毒性的分子，因此，?？舅厥且粋€理想的殺蟲肽存儲庫[25]。</p><p>　　黃?？ˋnthopLeura xanthogrammica）為?？苽?cè)花?？麑伲植加谖覈鴸|海沿岸以及日本沿海等，體壁呈暗綠色，表面有很多

22、縱行的疣突，體壁上有小孔，體內(nèi)的毒絲由小孔伸出孔外。在黃海葵體內(nèi)觀察到3種刺細胞，由于所處的位置不同，3種刺細胞的結(jié)構(gòu)與功能也不同。第1種為觸手上的刺絲囊，主要與捕食及運動有關(guān)，為黏性刺絲囊。第2種為隔膜絲上的刺細胞，刺針受到刺激后，刺絲囊才會放出刺絲。由此推測，內(nèi)部應(yīng)有卷纏刺絲囊，對進入消化腔的食物進行纏繞使其集中在腺體附近便于消化。第3種刺絲囊為穿刺刺絲囊，當受刺激時，刺絲向外翻出，把毒素射入捕獲物體內(nèi)，將其麻痹或殺死。</p

23、><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1材料</b></p><p><b>　　1.1.1實驗材料</b></p><p>　　本實驗所用的動物是舟山海域的黃?？ˋnthopLeura xanthogrammica），于2010年4月初，

24、采自舟山市朱家尖某沿海海域，淺海巖石上。經(jīng)浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院趙盛龍教授鑒定, 所采集的樣品為黃?？?lt;/p><p>　　水白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名脊尾白蝦(Holthuis) 購于舟山市定海區(qū)南珍菜場，購買需符合蝦的個體差異不大，重量均約為1.5g，新鮮程度高。在實驗室以海水飼養(yǎng)，保證其有頑強的生命活力。</p><p>　　黃粉蟲幼蟲(Teneb

25、rio molitor)，由浙江海洋學(xué)院（海洋生物資源及分子工程實驗室實驗室）提供。</p><p>　　昆明種小白鼠（Kunming mice），須是健康的小鼠，由浙江海洋學(xué)院（海洋生物資源及分子工程實驗室實驗室）提供。</p><p><b>　　1.1.2實驗儀器</b></p><p>　　Waters 600E型高效液相色譜

26、儀；高壓分子篩柱Sepax-100Å（7.8×300mm，Sepax公司）；分析型反相柱Waters SunFireTM C18 (4.6×250mm，Waters公司)；Tris-Tricine SDS-PAGE電泳試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；超純水處理系統(tǒng)（型號Millipore Syneg, Millipore公司）；真空冷凍干燥機（上海愛明儀器有限公司LGJ-10）；高速冷凍離心機（型號

27、CF16RXII,Hitachi Koki Co.,Ltd公司）；數(shù)控超聲波清洗器（型號KQ-500DB,昆山市超聲儀器有限公司）；</p><p><b>　　1.1.3實驗試劑</b></p><p>　　實驗用水為超純水；0.5M EDTA；2mg/mL抑肽酶；TFA；乙腈；無菌海水；0.45m針頭過濾器；微量注射器；50mL離心管；1.5mL離心管；40%丙烯

28、酰胺溶液；Tricine-SDS-PAGE制膠緩沖液；50%甘油；</p><p><b>　　1.2方法</b></p><p>　　1.2.1?？侄镜奶崛?lt;/p><p>　　本實驗采用的是反復(fù)凍融法提取?？侄緲悠贰?lt;/p><p>　　在舟山市朱家尖某沿海海域淺海巖石上，采集海葵樣品。樣品帶回實驗室后，進行鑒定

29、?？麡悠返念悇e，并對?？M行分類，從中我們選取黃?？鳛檠芯繉ο螅?lt;/p><p>　　鑒定后，所選取出的黃?？?，在實驗室中用海水進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度控制在25℃左右，時間為12hr左右；</p><p>　　從海水中取出飼養(yǎng)了12hr的黃?？麡悠罚⒂贸兯M行沖洗，待所有海葵都沖洗干凈后，將洗凈的黃海葵放置于燒杯中，然后把燒杯置于溫度為-80℃的冷凍箱中，迅速冷凍；</p>

30、<p>　　取一大燒杯（燒杯必須是清洗干凈的，并且用超純水沖洗過），倒入1000mL超純水，接著在燒杯中加入15mL的0.5M EDTA, 300μL 的2mg/mL抑肽酶，用玻璃棒（玻璃棒必須洗凈，并用超純水沖洗）將其充分混勻后，溶液備用；</p><p>　　從冷凍箱中取出冷凍完全的?？麡悠?，待其充分溶解后，將海葵樣品倒入在第（4）步中配置好的1000mL溶液中，并使?？麡悠啡拷]于溶液；<

31、;/p><p>　　將盛有?？麡悠返臒胖糜跍囟仍?80℃的冷凍箱內(nèi)，冷凍樣品；</p><p>　　待?？麡悠吩诶鋬鱿渲欣鋬隽?hr后，將充分冷凍的?？麡悠窂睦鋬鱿渲腥〕?，并將其置于溫度為4℃的冰箱中融化，使?？麡悠返玫匠浞秩诨?lt;/p><p>　　重復(fù)（5），（6）兩步3-4次；</p><p>　　待?？麡悠贩磸?fù)凍融4-5次后，將融化

32、后得到的?？麡悠酚眉啿紝ζ溥M行粗過濾，去掉?？|體等雜質(zhì)，過濾后得到的濾液備用；</p><p>　　將第（9）步中得到的濾液，分裝在數(shù)個50mL的離心管中，并將離心管放置于高速冷凍離心機中進行離心，離心條件：溫度設(shè)定為4°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定為20 000 rpm，離心的時間設(shè)定為20 min，待離心結(jié)束后，取出離心管，將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移到另一個50mL的離心管中；</p><p>

33、;　　?？麡悠分貜?fù)離心兩次，離心條件均為：溫度設(shè)定4°C、轉(zhuǎn)速設(shè)定20 000 rpm，離心時間設(shè)定20 min，離心介紹的樣品，將上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，備用，經(jīng)過多次離心得到的上清液即為?？侄緲悠?。</p><p>　　將經(jīng)過上述處理的所有?？侄緲悠分糜跍囟仁?°C的冰箱內(nèi)保存，備用。</p><p>　　1.2.2?？舅氐姆蛛x</p><p

34、>　　多維高效液相色譜法( multi dimensional high performance liquid chromatography , MDHPLC)是利用兩個或者更多的分子篩柱對樣品中待分析的組分進行多次的分離,將經(jīng)過初次分離的全部或部分組分用另一根或多根不同類型的色譜柱進行進一步的分離。利用多維高效液相色譜法技術(shù), 可適應(yīng)于各種不同的需要。其MDHPLC優(yōu)點如下：①提高色譜系統(tǒng)中的分離能力和選擇能力, 縮短樣品分析的

35、時間；②富集痕量組分,增加分析靈敏度；③從復(fù)雜的多種組分中，排除干擾物質(zhì), 有選擇的針對所需要的組分進行分析；④能起到樣品的預(yù)處理作用, 而且分析柱受到的污染也較少；⑤保護靈敏檢測器，避免其受污染；⑥實現(xiàn)自動化的控制常規(guī)分析, 且數(shù)據(jù)可靠, 重復(fù)性也好[26]。由于MDHPLC有諸多優(yōu)點,所以本實驗中采用的就是多維高效液相色譜法，對舟山黃?？侄緲悠愤M行分離純化。實驗中所有的分離步驟都是用Waters 600E型高效液相色譜儀完成的，并

36、且都是由Waters 2487型紫外檢測器做為分離純化實驗的檢測器，檢測波長為280nm。</p><p>　　取一溶劑瓶，加滿超純水，然后用超聲波震蕩10-15min，對超純水進行溶液脫氣處理，處理好的超純水作為洗脫液，依次打開Waters 600E型高效液相色譜儀的各個電源開關(guān)；</p><p>　　調(diào)節(jié)色譜儀的流速為1mL/min，對管路在不與色譜柱連接的情況下進行沖洗。待基線平穩(wěn)后

37、，關(guān)閉流速，將色譜柱（采用Sepax-100Å 7.8×300mm，Sepax公司）靠近泵的一端接入，另一端不接，在連接色譜柱時，要注意色譜柱的流向，色譜柱的流向必須與水的流向一致，開啟流速，對色譜柱進行沖洗，并觀察基線。待基線平穩(wěn)后，另一端也接入管路。繼續(xù)沖洗，待基線平穩(wěn)后，即可進行樣品進樣。</p><p>　　從冰箱內(nèi)取出海葵粗毒樣品，用0.45m針頭的過濾器對樣品進行過濾，得其濾液；&

38、lt;/p><p>　　對過濾后的樣品進行手動進樣，每次上樣1mL（?？麡悠繁仨毞胖迷跍囟仁?℃的條件下），并設(shè)置流速為0.75ml/min，觀察色譜圖，并且收集各個洗脫峰的樣品，對洗脫峰和對應(yīng)的樣品進行編號，為GF1~12，同時記錄色譜圖，收集好的洗脫峰樣品必須盡快的放入溫度為4℃的冰箱中保存；</p><p>　　每次測試完畢后，需對儀器進行沖洗，時間一般在30min-60min，一般流速

39、為正常測樣的1至1.5倍，然后走空白，如果顯示無任何雜質(zhì)，即可進行下一次上樣；若仍有雜質(zhì)顯示，則繼續(xù)沖洗，直至無雜質(zhì)為止，才能進行第二次的上樣；</p><p>　　從冰箱內(nèi)取出每次上樣后得到的洗脫峰樣品，將每次上樣所收集到的各個洗脫峰樣品進行合并于50mL的離心管中，并用封口膜對各個離心管進行封口，然后用小針頭在封口膜上進行打孔；</p><p>　　將封口好的樣品放置于溫度設(shè)定于-80

40、℃的冷凍箱內(nèi)，迅速凍干，時間約為1hr；</p><p>　　待一小時到后，取出凍干的樣品，并將離心管放置于冷凍干燥機中，完全干燥； </p><p>　　待樣品完全干燥后，將離心管從冷凍干燥機中取出，分別稱取少量各編號干燥后的樣品放置于1.5mL的離心管中，并在每個離心管中各加入0.5ml的無菌海水，并使樣品完全溶解于無菌海水中，備用；</p><p>　　取出微

41、量注射器并將其清洗干凈，注射器內(nèi)部先用超純水進行清洗，分別向水白蝦和黃粉蟲幼蟲分別注射無菌海水50μL，并觀察在無菌海水注射后，兩種動物身體的反應(yīng)，并記錄現(xiàn)象；</p><p>　　每次更換注射樣品時，必須對微量注射器用超純水進行清洗，防止在注射器中有上一個樣品的殘留，影響實驗的結(jié)果。用清洗好的微量注射器分別向水白蝦和黃粉蟲幼蟲注射溶解于無菌海水中的各個樣品，每個樣品各注射兩只水白蝦和黃蜂蟲，注射劑量為50μL/

42、只，并觀察注射不同編號樣品后，各動物的反應(yīng)。若注射同一個樣品的兩只動物反應(yīng)不一致，則應(yīng)該再注射兩只，直至反應(yīng)一致為止。并記錄各個編號對應(yīng)的動物反應(yīng)特征及各個洗脫峰是否具有殺蟲活性；</p><p>　　另取健康的昆明種小白鼠進行腹腔注射各個樣品，通過腹腔注射的方式進行不同編號樣品的殺蟲活性的測試，觀察注射不同編號樣品后，各小鼠的身體反應(yīng)。并記錄活性測試的結(jié)果以及各個洗脫峰是否具有殺蟲活性；</p>

43、<p>　　通過第（11）、（12）步的檢測，得到的具有殺蟲活性的洗脫峰樣品編號，找到對應(yīng)編號的樣品組分，合并具有殺蟲活性的各個組分的樣品，合并后的?？舅貥悠贩胖糜跍囟葹?℃的冰箱中保存，備用；</p><p>　　從Waters 600E型高效液相色譜儀上取下Sepax-100Å色譜柱（7.8×300mm，Sepax公司生產(chǎn)），配制兩份溶液一份為含0.1%TFA的超純水（A液），

44、另一份是乙腈（B液），配制好的兩份溶液均用超聲波震蕩10-15min，對兩份溶液進行脫氣處理，處理過的液體作為反相液相色譜的洗脫液，先對管路在不與色譜柱連接的情況下進行沖洗。待基線平穩(wěn)后，對反相色譜柱（采用SunfireTM Prep C8,10×250 mm, Waters公司）半制備柱進行沖洗，待基線平穩(wěn)后，即可進行樣品進樣。</p><p>　　從冰箱取出第（13）步得到的?？舅貥悠?，手動對樣品

45、進行上樣，每次上樣5mL。沒有進行上樣的海葵毒素樣品，仍需放在4℃的溫度下。設(shè)置洗脫的流速為2 mL/min，洗脫的梯度設(shè)定為0-5%B，10min；5%-45%B，30min；45%-95%B，5min。設(shè)置梯度完成后，即可運行程序，并觀察樣品的色譜圖，收集每個洗脫峰的樣品，然后對洗脫峰和對應(yīng)的樣品進行編號，記為R1~12，同時在記錄本上畫下色譜圖，收集好的洗脫峰樣品同樣須盡快的放入溫度為4℃的冰箱中保存；</p>&l

46、t;p>　　重復(fù)（5）—（12）步驟，對所有的?？舅貥悠愤M行SunfireTM Prep C8的反相色譜柱的洗脫，冷凍干燥后，R1~12的12組樣品在動物體上做殺蟲活性的檢測；從中得到具有殺蟲活性的洗脫峰樣品的編號，找到對應(yīng)編號的樣品組分，對具有殺蟲活性的各個組分的樣品進行合并，合并后?？舅貥悠芳皶r放于溫度為4℃的冰箱中保存，備用；</p><p>　　從高效液相色譜儀上取下SunfireTM Prep

47、 C8的反相色譜柱（10×250 mm, Waters公司生產(chǎn)），洗脫液仍然是一份為含0.1%TFA的超純水（A液），一份是乙腈（B液），兩份溶液用超聲波震蕩10-15min后即可使用。先對管路在不與色譜柱連接的情況下進行沖洗。待基線平穩(wěn)后，對分析型反相柱Waters SunFireTM C18 (4.6×250mm，Waters公司)進行沖洗，待基線平穩(wěn)后，即可進行樣品進樣。</p><p&g

48、t;　　從冰箱取出第（16）步得到的?？舅貥悠?，手動對樣品進行上樣，每次上樣1mL。沒有進行上樣的?？舅貥悠罚柙?℃的溫度下保存。設(shè)置洗脫的流速為0.75mL/min，洗脫的梯度設(shè)定為0-5%B，10min；5%-45%B，30min；45%-95%B，5min。當設(shè)置梯度完成，對梯度進行保存后，即可運行程序，并觀察樣品色譜圖，收集各個洗脫峰的樣品，然后對洗脫峰和對應(yīng)的樣品進行編號，同時在記錄本上畫下色譜圖，收集好的洗脫峰樣品同樣

49、須盡快的放入溫度為4℃的冰箱中保存；</p><p>　　重復(fù)（5）—（12）步驟，對所有的?？舅貥悠愤M行Waters SunFireTM C18的反相色譜柱的洗脫，冷凍干燥后，所有得到的各個樣品在動物體上做殺蟲活性的檢測；從中得到具有殺蟲活性的洗脫峰樣品的編號，找到對應(yīng)編號的樣品組分，對具有殺蟲活性的各個組分的樣品進行合并，合并后海葵毒素樣品及時放于溫度為4℃的冰箱中保存；</p><p

50、>　　1.2.3 毒素多肽的用Tris-Tricine SDS-PAGE電泳</p><p>　　實驗中采用Tris-Tricine SDS-PAGE電泳（購自北京天恩澤基因科技有限公司）試劑盒對分離后，各洗脫峰的殺蟲毒素多肽的分子量進行初步的檢測。</p><p>　　將2塊干凈的玻璃板和2個0.75 mm的隔條，組裝玻璃平板夾層，并將其固定在灌膠支架上。</p>&

51、lt;p>　　根據(jù)平板的面積、需要制備的膠的厚度，估計需要配制的分離膠（seperating gel）和濃縮膠（stacking gel）的體積。</p><p><b>　　配制分離膠</b></p><p>　　新鮮配制10%的APS（過硫酸銨）：按每0.1克過硫酸銨干粉加1mL超純水的比例將水加到裝有硫酸銨干粉的1.5mL EP管中，搖晃到粉末全部溶解。配

52、制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。</p><p>　　在一個25mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、40%丙烯酰胺溶液和4×分離膠緩沖液。以下是配制10 mL膠的用量，更大體積則各成分用量需按比例增加。丙烯酰胺單體具有神經(jīng)毒性，一定要戴手套操作。</p><p>　　搖晃混勻后抽真空10-15分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng)，不去除將影響丙烯酰胺聚

53、合反應(yīng)）。</p><p>　　將50uL新鮮配制的 10%過硫酸銨溶液和10uL TEMED溶液加入到溶液中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。</p><p>　　灌膠。用一根巴斯德吸管，將分離膠溶液沿著一條隔條的邊緣加到玻璃板夾層中，直到玻璃板之間溶液的高度約為11cm。</p><p>　　用另一根巴斯德吸管，先從一側(cè)的隔條邊緣，再從另一側(cè)的隔條邊緣緩慢的往凝膠的頂部加入一層水

54、飽和的異丁醇（厚約1cm），讓凝膠在室溫聚合30-60min。</p><p>　　傾去異丁醇，用1×Tricine-SDS-PAGE制膠緩沖液徹底沖洗后，待用。</p><p><b>　　配制4%濃縮膠</b></p><p>　　在一個50mL的三角瓶中，先按下表的用量加入水、40%丙烯酰胺溶液和Tricine-SDS-PAGE

55、制膠緩沖液。以下是配制12.5 mL膠的用量，丙烯酰胺單體具有神經(jīng)毒性，一定要戴手套操作。</p><p>　　搖晃混勻后抽真空10-15分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng)，不去除將影響丙烯酰胺聚合反應(yīng)）。</p><p>　　將50uL新鮮配制的 10%的過硫化銨溶液和10uL TEMED溶液加入到溶液中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。</p><p>　　灌膠。

56、用巴斯德吸管，將積層膠溶液緩緩地沿著一側(cè)隔條的邊緣加到玻璃板夾層中，直到玻璃板夾層中的溶液高度離玻璃板頂部約1cm高為止。小心不要產(chǎn)生氣泡。</p><p>　　插入0.75mm厚的塑料梳子，再補加濃縮膠溶液填滿梳子間的空隙，仍然注意避免產(chǎn)生氣泡。讓濃縮膠在室溫聚合30-60分鐘（低溫抑制聚合反應(yīng)）。</p><p>　　小心拔出梳子，避免撕裂凝膠加樣孔。用陰極緩沖液沖洗并加滿加樣孔。&l

57、t;/p><p>　　在電泳裝置的下層緩沖液槽中加入陽極緩沖液（產(chǎn)品提供10 升的陽極緩沖液干粉，將所有干粉溶解在1000mL 水中，用濃鹽酸調(diào)pH 到8.9（25℃）即得10×陽極緩沖液，滅菌后可以4℃放置，用時再用水稀釋成1×陽極緩沖液）安裝電泳裝置，并根據(jù)廠商說明書固定上層緩沖槽。在上層緩沖槽中加入部分陰極緩沖液（產(chǎn)品提供10 升的陰極緩沖液干粉，將所有干粉溶解在1000mL 水中即得10&

58、#215;陰極緩沖液，可以室溫放置，不需要滅菌，用時再用水稀釋成1×陰極緩沖液。）至覆蓋加樣孔為止。</p><p>　　在密封的螺蓋微量離心管中，用2×Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液按1：1的比例稀釋蛋白樣品，于100℃煮沸3-5 min。 如果樣品是蛋白沉淀物，加入50-100 uL 新配的1×Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液溶解；如果樣品是蛋白稀溶液，可考

59、慮先濃縮蛋白質(zhì)。注：用考馬斯亮藍染色時，對于成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，0.8 cm寬的加樣孔的加樣體積不超過20 uL（25-50 uL總蛋白質(zhì)）為宜，對于只有一種或幾種蛋白質(zhì)的樣品，只需1-10 uL的總蛋白質(zhì)。采用銀染時，樣品用量可減少10-100倍。為了得到均一的條帶，配制蛋白質(zhì)樣品時，濃度和等體積要相同。在加入Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液前后，要將樣品一直放于冰上。含Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液的樣品，

60、如未經(jīng)100℃加熱滅活蛋白酶之前，切勿將其放于室溫。</p><p>　　開始電泳，先在30 V恒壓下電泳1 h（對0.75mm×14cm×14cm 的膠而言），接著在150 V恒壓下電泳4-5 h。注：本產(chǎn)品的Tricine-SDS-PAGE上樣液使用了考馬斯亮藍G-250作為指示劑，其泳動速度比最小的肽還快。</p><p>　　終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)的染色等處

61、理。</p><p>　　戴上手套避免將手指印留在電泳膠上，將膠移入一個小的盛有少量考馬斯亮藍（20ml已經(jīng)足夠）的容器內(nèi)（小心不要將膠撕破）?；蛘邔⒉ＡО暹B同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直至凝膠脫落；</p><p>　　對于0.75mm的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩5-10min，對于1.5mm的凝膠，則需要10-20min，在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器口；</p>

62、<p>　　棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色；</p><p>　　加入考馬斯亮藍脫色液（約50ml），清晰的條帶很快會顯現(xiàn)出來，大部分凝膠脫色需要1h，使用過的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需數(shù)次更換脫色液并震蕩過夜，得到電泳圖譜</p><p>　　1.2.4通過質(zhì)譜分析對毒素多肽進行初步的鑒定</p><p>　　海葵殺蟲

63、活性多肽的精確分子量是利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）（Voyager-DESTR Biospectromitry workstation，Applied Biosystems公司）進行測定。采用線性陽離子模式，N2光源為337 nm，離子加速電壓為20000 V。基質(zhì)采用α-氰基-4-羥基-肉桂酸（CCA，sigma公司），通過以下方式制備樣品：取1 L 樣品液加入到9 LCCA（含 0.1%TFA）的50%

64、乙腈飽和溶液。混勻后取1 L點樣，室溫干燥后測定，并采用內(nèi)標法校正。</p><p><b>　　2 實驗結(jié)果</b></p><p>　　2.1?？舅亟?jīng)Sepax-100A色譜柱第一次分離</p><p>　　從舟山海域黃?？刑崛〉玫降拇侄緲悠罚?jīng)過Sepax-100A色譜柱的分離后，根據(jù)其分離圖譜（圖1），可收集到12個洗脫峰。根據(jù)洗脫

65、峰出現(xiàn)的先后順序，將其依次命名為GF1-GF12（圖1）。實驗收集得到的12個洗脫峰經(jīng)過冷凍干燥處理后，各樣品取溶解于等量的無菌海水，將其注射于水白蝦以及黃粉蟲幼蟲體內(nèi)，得到12個洗脫峰注射動物后不同的反應(yīng)（表1）。通過表1可以發(fā)現(xiàn)12個洗脫峰中，以GF2和GF3的毒性最強。其中經(jīng)GF2和GF3樣品注射后的水白蝦及黃粉蟲幼蟲均立刻產(chǎn)生抽搐并迅速死亡；經(jīng)GF1，GF5-GF12這9個樣品注射后的水白蝦以及黃粉蟲都沒有明顯反應(yīng)，繼續(xù)存活；經(jīng)

66、GF4樣品注射后的水白蝦以及黃粉蟲，身體先產(chǎn)生抽搐，再經(jīng)過2-5分鐘后才死亡。將毒性最強的兩組樣品對小鼠腹腔注射后，都導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)癱軟，呼吸困難等癥狀。而實驗中注射了無菌海水的水白蝦、黃粉蟲以及小鼠，在注射后都無明顯現(xiàn)象產(chǎn)生。</p><p>　　圖1：?？侄窘?jīng)Sepax-100Å分子篩分離的圖譜，共收集12個洗脫峰，分別命名為GF1~12</p><p>　　Fig.1. S

67、epax-100Å gel filtration of peptide. Sample, the crude extract from AnthopLeura xanthogrammica. fractions collected is labeled from GF1 to GF12.</p><p>　　表1：海葵粗毒經(jīng)Sepax-100Å分子篩分離得到的各洗脫峰，注射水白蝦后產(chǎn)生的現(xiàn)象

68、</p><p>　　Table 1.Reactions of the Exopalaemon carinicauda after injection of the Sepax-100Å gel-filtration fractions of toxins from AnthopLeura xanthogrammica.</p><p>　　2.2 ?？舅亟?jīng)C8半制備型反相HP

69、LC第二次分離</p><p>　　經(jīng)過Sepax-100A色譜柱第一次分離和對洗脫峰進行進行殺蟲活性分析后，得到了其中毒性最強是GF2和GF3號峰，將這兩個毒性最強的樣品進行合并。樣品用SunfireTM Prep C8半制備型色譜柱進行反相HPLC，對GF2,GF3進一步分離。樣品通過反相液相色譜洗脫后，根據(jù)樣品反相色譜圖（圖2）共收集到12個洗脫峰組分。并根據(jù)洗脫時間的先后順序分別命名為R1~12（圖2）。

70、所有洗脫峰組分經(jīng)過冷凍干燥、無菌海水溶解后，對其進行動物毒性的測試。測試結(jié)果表明R1，R3，R5~10以及R11具有較強活性，注射后的水白蝦及黃粉蟲幼蟲均立刻產(chǎn)生抽搐并迅速死亡；R1，R11，R12三個組分活性較弱，注射后的水白蝦以及黃粉蟲，身體先產(chǎn)生抽搐，再經(jīng)數(shù)分鐘后才死亡；R2，R4兩個組分活性很弱，幾乎沒有活性，注射后的水白蝦以及黃粉蟲都沒有明顯反應(yīng)，繼續(xù)存活（表2）。并對R1-12這12個組分進行Tris-Tricine SDS

71、-PAGE電泳檢測，得到凝膠。并經(jīng)過染色和脫色處理后，得到了清晰的電泳檢測圖譜（圖3：A圖R1~R7組分的電泳檢測圖譜；B圖R8~R12的電泳檢測圖譜?！埃贝韺λ孜r以及黃粉</p><p>　　圖2：GF2+GF3號峰經(jīng)C8反相柱分離后的圖譜，共收集12個組分，分別命名為R1~12。</p><p>　　Fig.2. Reverse-phase HPLC of fraction G

72、F2+GF3 obtained from the above gel filtration. Sample, toxic fractions obtained by gel filtration; column, SunfireTM Prep C8</p><p>　　表2：GF2+GF3號峰經(jīng)C8反相柱分離得到的各洗脫峰，注射水白蝦后產(chǎn)生的現(xiàn)象</p><p>　　Table 2 . R

73、eactions of the Exopalaemon carinicauda after injection of the fractions after SunfireTM Prep C8 column of GF2+GF3 toxins from AnthopLeura xanthogrammica.</p><p>　　圖3：GF2+GF3號峰經(jīng)C8反相柱分離后，各洗脫峰的Tris-Tricine SDS

74、-PAGE電泳檢測圖譜。</p><p>　　Fig.3. Tris-Tricine SDS-PAGE of the fractions obtained from the above RP-HPLC SunfireTM Prep C8</p><p>　　2.3海葵毒素經(jīng)分析型C18反相柱第三次分離</p><p>　　?？侄窘?jīng)過Sepax-100A色譜柱第一次

75、分離和SunfireTM Prep C8半制備型色譜柱進行反相液相色譜的第二次分離，分離得到的12個洗脫峰中選擇R5,R6,R7,R8以及R11這5個具有較強毒性的組分。得到的五個具有較強毒性的組分分別用分析型C18反相柱進行分離，各組分得到的分離圖譜如圖4所示。對五個組分的各個洗脫峰進行了動物毒性檢測，其中在R5樣品檢測到一個具有較強毒性的組分，命名為R5-1；在R6中檢測到毒性組分并命名R6-1。同理，在R7、R8、R11中得到了五

76、個具有較強毒性的組分，分別命名為R7-1，R7-2，R8-1，R8-2以及R11-1（圖4）。在動物毒性檢測時，這7種多肽對水白蝦以及黃粉蟲幼蟲均具有很強的致死活性，在注射后可立刻導(dǎo)致實驗動物抽搐、痙攣并迅速死亡。但這七種多肽在同等濃度下對小鼠無致死活性，但可引起小鼠出現(xiàn)癱軟癥狀。</p><p>　　圖4：R5~R8以及R11經(jīng)C18反相分離后的圖譜，經(jīng)動物毒性檢測，收集7個活性組分，分別命名為R5-1, R6

77、-1, R7-1, R7-2, R8-1, R8-2和R11-1。</p><p>　　Fig.4. Reverse-phase HPLC of toxic fractions obtained from the above RP HPLC SunfireTM Prep C8. column, SunfireTM Prep C18;</p><p>　　2.4對分離后的海葵毒素質(zhì)譜分析&l

78、t;/p><p>　　海葵粗毒經(jīng)過多維高效液相色譜的分離純化和動物毒性檢測，最終得到的7個活性組分分別為R5-1, R6-1, R7-1, R7-2, R8-1, R8-2和R11-1。然后對這七個樣品組分分別利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行質(zhì)譜分析。通過質(zhì)譜分析來確定舟山黃?？懈鱾€殺蟲活性多肽的精確分子量。各組分質(zhì)譜分析得到R5-1的分子量為3226.02, R6-1的分子量為3252.37，R7-1的分

79、子量為5021.85，R7-2的分子量為4507.32，R8-1的分子量為5018.03，R8-2的分子量為3826.98，R11-1的分子量為2788.31（圖5）。從7個活性組分的各個分子量的大小表明，舟山黃?？幕钚詺⑾x肽的分子量在2~5 kDa之間（圖5）。其中R8-1多肽得到的多肽片段的氨基酸序列為GGVPCLCDSDGPSVRGNTLSGIIWLRGCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQ。</p><

80、p>　　圖5：7種舟山黃?？麣⑾x肽的質(zhì)譜分析圖，表明這些殺蟲肽的分子量在2~5 kDa之間。</p><p>　　Fig.5. Mass spectrometric analysis of target peptides，revealed molecular masses of 5027 and 5043Da indicating the occurrence of a single oxidated fo

81、rm as the major isolation product.</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　目前，?？舅厥巧锒舅貧⑾x肽開發(fā)的主要研究對象，從?？舅匾呀?jīng)發(fā)現(xiàn)不少的多肽毒素，對甲殼類的動物具有特異致死或麻痹的作用，而對哺乳動物沒有活性或者低毒性，其對甲殼動物所表現(xiàn)出的選擇性毒理作用使其有望成為開發(fā)殺蟲肽的先導(dǎo)分子[1]，但該類

82、多肽毒素的作用靶點尚不清楚，因為昆蟲細胞的培養(yǎng)難度較大，因而從細胞水平了解?？舅貙ハx的毒性機理尚存在不少困難。</p><p>　　海葵毒素作為研究的熱點, 主要有AP-A及AP-B兩種, AP-A特異結(jié)合在心臟Na+通道上, AP-B對心臟和骨骼肌的通道均能緊密結(jié)合, 它們都有顯著的強心作用。除此二種?？舅赝?Kelso等從黃海葵中發(fā)現(xiàn)6種新毒素。其中5種類似從A.elegantissima, A.fus

83、coviridis和Anmonia sulcata中分離得到的47個殘基的I型長肽, 還有一種似乎是從A.xanthogrammica中得到的兩種49肽的嵌合體。用離子流方法在RT-4B和NTE-115細胞系中分別純化和定性;一種命名為PCR2-10，47肽能增加藜蘆定依賴型的Na+攝入, 在RT-4B和NIE-115種細胞系中的K0.5分別為329 nmol/L和1354 nmol/L. 49肽與Na+通道結(jié)合更緊密, 在上述兩種細胞

84、系中的K0.5分別為47nmol/L和108nmol/L[27].</p><p>　　目前，從海葵毒素中鑒定到的對甲殼類動物具有特異毒性的多肽分子已經(jīng)超過12種，例如, 來自海葵Anemonia erythraea 的AETX III，由59個氨基酸殘基組成，序列中含10 個半胱氨酸，對蟹的半致死濃度( LD50) 分別為0.53 和0.28 μg/kg體重，是目前發(fā)現(xiàn)的對甲殼類動物毒性最強的多肽分子[28]；

85、來自?？鸖tichodactyla gigantea 的gigantoxin I，能快速麻痹蟹類，其半有效濃度( ED50) 為215 μg/kg[29]；從?？鸄ntheopsis maculate 的毒素中分離到兩種對甲殼類具有特異毒性的分子，分別為Am I和Am II，其中，Am I由27 個氨基酸殘基組成，對蟹類具有致死活性，其LD50 為830 μg/kg，AmII 由46 個氨基酸殘基組成，對蟹類具有麻痹活性，其ED50 為

86、420 μg/kg[30]；HONME 等人最近還從海葵Stichodactyla haddoni 中分離到4 種新型多肽毒素，分別命名為SHTX- I，II，III 和IV，其中，SHTX- 1 和II 由28 個氨基酸組成，對蟹</p><p>　　?？谶M化過程中發(fā)展了一套行之有效的毒素系統(tǒng)，可以用來捕獲行動敏捷的甲殼類以及其他獵物。我們的研究結(jié)果表明，舟山黃?？拇侄驹?00μg/kg體重濃度下注射水白蝦

87、后，在1分鐘內(nèi)即可導(dǎo)致實驗動物的麻痹，抽搐然后死亡；其對黃粉蟲幼蟲的毒性同樣表現(xiàn)出快速的特征，這表明舟山黃海葵粗毒中富含對節(jié)肢動物有毒性的分子，且毒性較強。通過采用多維高效液相色譜分離結(jié)合動物毒性實驗，我們最終從舟山黃海葵的粗毒中分離到7種對水白蝦和黃粉蟲幼蟲具有殺傷作用的毒素多肽分子，在100 μg/kg 體重濃度下可導(dǎo)致水白蝦以及黃粉蟲幼蟲的快速致死作用，其對節(jié)肢動物的毒性較強；盡管這7種毒素分子在小鼠腹腔注射后也具有毒性，但相對毒

88、性較弱，因此有望成為開發(fā)殺蟲肽的先導(dǎo)分子。質(zhì)譜分析表明，這7種舟山黃?？舅囟嚯姆肿恿吭?~5kDa左右，與已知的?？麣⑾x肽分子量接近，均屬于小肽分子，目前，關(guān)于這7種多肽毒素的序列分析以及毒性機制仍在深入進行中。上述研究結(jié)果表明，作為舟山海域常見的一種黃?？?，舟山黃?？舅刂懈缓鞣N毒素多肽，是一個研究和開發(fā)殺蟲肽以及其他活性物質(zhì)的寶庫。</p><p>　　在當今這個科技發(fā)達的世界里，越來越多的的人發(fā)現(xiàn)，新領(lǐng)

89、域的生物資源和活性物質(zhì)方面的拓展將在在未來科技和經(jīng)濟競爭中占據(jù)了首要的地位。海洋藥物基因、蛋白質(zhì)工程、海洋保健品開發(fā)已經(jīng)成為海洋高技術(shù)研究領(lǐng)域的一大熱點。制備具有各種生理活性的海洋生物活性肽，應(yīng)用于藥物及保健品開發(fā)，也已經(jīng)在世界各國展開[32]。</p><p>　　海葵其毒液中富含了各種多肽類的神經(jīng)毒素，分子量為 3-7kDa 之間。其分子序列中含有多對二硫鍵，以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。海葵的神經(jīng)毒素以鉀離子通道毒素和鈉離

90、子通道毒素作為主要成分。同時還發(fā)現(xiàn)了有作用在其他離子通道的成分。此外，還有部分的?？舅啬壳吧胁磺宄浞肿?。不同的海葵個體、不同類型的海葵毒素具有不同空間結(jié)構(gòu)。海葵毒素多肽分子的多樣性使其成為了動物毒素研究的重要分支。同時，?？嚯亩舅貙Σ煌x子通道的高親和性和特異性，使它們成為了神經(jīng)生理學(xué)研究和藥理學(xué)研究的一種重要的工具。</p><p>　　現(xiàn)代藥理研究表明許多海洋生物次生代謝產(chǎn)物對害蟲有較好的防效。?？陂L

91、期的進化過程中產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨特的物質(zhì)。這些物質(zhì)的主要作用是防范潛在天敵的進攻及捕食作用。?？矬w內(nèi)的生物活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性、多樣性和特殊性，為尋找新的生物農(nóng)藥提供了有利條件。</p><p>　　總之，開發(fā)海洋多肽類化合物，并使之商業(yè)化，不僅能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益，而且可因其獨特的效用而造福于人類。?？钚噪牡馁Y源非常大，海葵活性肽是一座寶庫,有待于人類進一步去挖掘，它必將為人類的健康事業(yè)和生物農(nóng)業(yè)的開發(fā)

92、方面做出越來越大的貢獻。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　劉濟寧,余向陽,張存政等,海洋生物源殺蟲活性物質(zhì)研究進展[J].昆蟲知識.2004, 41(5): 409-413.</p><p>　　Kazuo Shiomi. Novel peptide toxins recently isolate

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