蜘蛛毒素與電壓門(mén)控離子通道作用機(jī)制研究.pdf

1、Jingzhaotoxin-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)是從我國(guó)特有的敬釗纓毛蛛中分離得到的一種多肽毒素，它能夠選擇性的作用于大鼠心肌細(xì)胞并使心肌鈉離子通道的激活往去極化方向漂移。我們采用酵母發(fā)酵系統(tǒng)成功的表達(dá)了JZTX-Ⅲ以及其18個(gè)突變體，其中除F7A表達(dá)量太低外其他的突變體表達(dá)量約為4 mg/L。表達(dá)的JZTX-Ⅲ以及突變體的CD圖譜和天然JZTX-Ⅲ的基本一致，因此CD譜檢測(cè)證明表達(dá)的毒素以及突變體并沒(méi)有發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變。膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)

2、的JZTX-Ⅲ能夠選擇性的抑制Nav1.5電流(IC50為348.0±67.9 nM)，同時(shí)毒素能使Nav1.5往去極化方向漂移約+13 mV但不改變鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活。因此，表達(dá)的JZTX-Ⅲ和天然的JZTX-Ⅲ在結(jié)構(gòu)和功能上都保持一致。檢測(cè)毒素突變體和Nav1.5的親和力發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)酸性殘基(Asp1、Glu3)和一個(gè)暴露在毒素表面由色氨酸構(gòu)成的疏水性斑片(Trp8、Trp9、Trp28、Trp29、Trp30)是JZTX-Ⅲ和Nav1

3、.5作用的關(guān)鍵殘基，另外一個(gè)堿性殘基Arg13突變成Glu后使毒素和通道的親和力增強(qiáng)了十倍。對(duì)Nav1.5 DII S3-S4連接環(huán)上的氨基酸殘基進(jìn)行了丙氨酸掃描后，發(fā)現(xiàn)Nav1.5的突變體S799A、R800A、L804A能顯著的降低JZTX-Ⅲ和Nav1.5的親和力，這些氨基酸殘基可能是JZTX-Ⅲ結(jié)合鈉通道的關(guān)鍵殘基。將Nav1.5和其他鈉通道亞型的DIIS3-S4氨基酸序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)R800為Nav1.5所特有的氨基酸。Nav1

4、.7上相應(yīng)的位點(diǎn)D816突變成D816R增強(qiáng)了JZTX-Ⅲ和Nav1.7的親和力，Nav1.5突變體R800D使毒素和通道的親和力降低約72倍。JZTX-Ⅲ通過(guò)酸性氨基酸殘基和Nav1.5 DII S3-S4鏈接環(huán)上的堿性氨基酸殘基相互作用，這種作用機(jī)制不同于以往的毒素，因此JZTX-Ⅲ可以作為毒素和鈉通道結(jié)構(gòu)和功能研究的工具試劑。
　　 Huwentoxin-Ⅳ(MHWTX-Ⅳ)修飾體是從虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒中分離得到的一種發(fā)生翻譯

5、后修飾的毒素。質(zhì)譜檢測(cè)表明mHWTX-Ⅳ分子量比天然HWTX-Ⅳ的分子量少18 Da。采用質(zhì)譜進(jìn)一步的分析毒素的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)HWTX-Ⅳ的N端谷氨酸脫水環(huán)化形成焦谷氨酸導(dǎo)致分子量減少18 Da。全細(xì)胞膜片鉗顯示，MHWTX-Ⅳ選擇性的抑制大鼠DRG神經(jīng)元上的TTX-S鈉離子通道(IC50～54.16±7.3 nM)，而對(duì)大鼠DRG細(xì)胞的TTX-R鈉離子通道以及其他的電壓門(mén)控離子通道都沒(méi)有影響。和天然HWTX-Ⅳ一樣，HWTX-Ⅳ修飾

6、體不改變TTX-S鈉離子通道的I-V曲線、電導(dǎo)曲線以及穩(wěn)態(tài)失活曲線。HWTX-Ⅳ抑制的鈉離子通道在高電壓刺激下與鈉離子通道解離，鈉電流基本完全恢復(fù)，但被HWTX-Ⅳ修飾體抑制的鈉電流在高電壓(+200 mv，500 ms)刺激下依然沒(méi)有恢復(fù)，證明HWTX-Ⅳ修飾體在高電壓的刺激下與鈉離子通道依然緊密結(jié)合。這有可能是谷氨酸環(huán)化形成焦谷氨酸后導(dǎo)致毒素缺失一個(gè)負(fù)電荷，從而使毒素和鈉通道上的負(fù)電荷殘基的結(jié)合更加緊密。這是第一次報(bào)道在蜘蛛毒素中有

7、焦谷氨酸的存在，并且第一次證明焦谷氨酸能夠增強(qiáng)HWTX-Ⅳ修飾體和鈉離子通道的結(jié)合。
　　 JZTX-34是敬釗纓毛蛛中分離得到一種新的多肽毒素，由于該毒素在粗度中的含量較小，因此采用釀酒酵母表達(dá)該毒素。JZTX-34含有35個(gè)氨基酸殘基其中包括三對(duì)半胱氨酸形成二硫鍵，推測(cè)其可能為ICK結(jié)構(gòu)模體的多肽毒素。JZTX-34能選擇性作用于大鼠DRG細(xì)胞上的TTX-S鈉通道(IC50～85 nM)，但是對(duì)TTX-R鈉通道以及鈣通道和鉀

8、通道無(wú)明顯抑制作用。JZTX-34能選擇性抑制大鼠DRG細(xì)胞上的TTX-S鈉電流并使鈉通道穩(wěn)態(tài)失活往去極化方向漂移10 mV，但是毒素卻不改變鈉通道的激活。JZTX-34在高電壓刺激(+120 mv)下與鈉通道發(fā)生解離，抑制消除。因此，我們推測(cè)JZTX-34是一個(gè)位點(diǎn)4的毒素可能結(jié)合鈉通道的電壓敏感元件。
　　 虎紋捕鳥(niǎo)蛛(Ornithoctonus huwena)是分布于我國(guó)南方毒性最強(qiáng)的蜘蛛之一，其毒液中含有大量的多肽毒素能

9、夠快速的殺死獵物。HWTX-Ⅰ和HWTX-Ⅱ是虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒中兩種最豐富的成分，HWTX-Ⅰ是一個(gè)雙功能活性分子既能抑制大鼠DRG神經(jīng)元TTX-S鈉通道(IC50～57.40±1.42 nM)又能專一抑制N-型鈣通道(IC50～91 nM)，但是10μM HWTX-Ⅱ?qū)Υ笫驞RG神經(jīng)元細(xì)胞上鈉離子通道和鈣離子通道均無(wú)明顯作用。HWTX-Ⅱ和HWTX-Ⅰ混合后共同作用于TTX-S鈉通道與N-型鈣通道其活性分別增加10倍和6倍。進(jìn)一步研究表