東海大型水母刺絲囊分離鑒定及毒素蛋白純化研究.pdf

1、近年來全世界許多海域出現(xiàn)了浮游動(dòng)物水母暴發(fā)的問題，水母的反復(fù)暴發(fā)對(duì)于游客、海水浴者尤其是海洋從業(yè)人員存在著健康和經(jīng)濟(jì)方面的嚴(yán)重威脅。水母屬于刺胞動(dòng)物門，包括整個(gè)缽水母綱以及水螅蟲綱的少數(shù)種類，共約300余種，其中對(duì)人類有害的約100種。水母的身體呈傘狀，體型大小相去甚遠(yuǎn)，水母觸手布滿刺絲囊，一旦受激便高速發(fā)射帶有倒鉤的刺絲進(jìn)入獵物體內(nèi)并注毒，導(dǎo)致蜇傷。不同種屬水母的刺絲囊有著較大的差異，同一種水母的刺絲囊也形態(tài)多樣，在水母的進(jìn)化、生存等

2、方面承擔(dān)著不同的作用。
　　刺絲囊內(nèi)毒液主要由蛋白和肽類毒素構(gòu)成，通常水母蜇傷僅造成局部癥狀，但心血管、溶血和神經(jīng)并發(fā)癥也時(shí)有發(fā)生。目前尚無單一蛋白成分的腔腸動(dòng)物心血管毒素報(bào)道，關(guān)于溶血毒素的報(bào)道主要來自對(duì)棲底生物的研究，如?？⑸汉飨x，近年來在幾種管水母，方水母，缽水母中同樣發(fā)現(xiàn)了溶血毒素，且這些營(yíng)浮游生活的水母與人類蜇傷更為相關(guān)。
　　研究目的:
　　本課題的研究對(duì)象為中國(guó)東南海域水母暴發(fā)的主要大型品種——發(fā)形霞水

3、母(Cyanea capillata)與越前水母（Nemopilema nomurai）。為深入了解這兩種水母刺絲囊毒素蛋白的活性與蜇傷機(jī)理，首先分離鑒別其未發(fā)射刺絲囊及同種水母單型刺絲囊，繼而獲得刺絲囊毒素蛋白，分析比較不同類型刺絲囊毒素的心血管活性和溶血活性，并以活性為導(dǎo)向，對(duì)水母刺絲囊毒素蛋白進(jìn)行分離純化。
　　研究方法:
　　1、發(fā)形霞水母及越前水母刺絲囊的制備:建立抑制刺絲囊發(fā)射的制備體系，利用水母組織與刺絲囊，以

4、及單型刺絲囊之間大小、密度、沉降系數(shù)的不同，通過分級(jí)過篩、密度梯度離心的方法，制備保留生物活性的水母未發(fā)射刺絲囊。
　　2、水母刺絲囊毒素蛋白獲取，活性檢測(cè)和定位:低溫超聲破碎法獲取水母刺絲囊毒素蛋白。通過大鼠血壓監(jiān)測(cè)，溶血活性測(cè)定法評(píng)價(jià)比較東海大型水母刺絲囊毒性，以及越前水母兩種單型刺絲囊的毒素活性，確定心血管活性和溶血活性存在的位置。
　　3、越前水母刺絲囊心血管和溶血活性蛋白的定向純化:利用凝膠過濾層析和HPLC反相層

5、析，結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜分析，對(duì)越前水母刺絲囊毒素(Nemopilema nomurai nematocyst venom，NNV)進(jìn)行分離純化，并篩選其中具有心血管活性和溶血活性的組分。
　　研究結(jié)果:
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功制備了大量純凈未發(fā)射的水母刺絲囊及單型刺絲囊。經(jīng)鑒定，中國(guó)東海海域的發(fā)形霞水母觸手包含的刺絲囊有:①b-長(zhǎng)棒型中軸穿刺絲囊②多倒刺啞鈴型中軸穿刺絲囊③緊密刺絲等直徑型鉤刺絲囊④松散刺絲等直徑型鉤刺絲

6、囊;越前水母觸手包含的刺絲囊有:①松散刺絲等直徑型鉤刺絲囊②多倒刺啞鈴型中軸穿刺絲囊③緊密刺絲等直徑型鉤刺絲囊④刺絲漸細(xì)型鉤刺絲囊。該方法制備的刺絲囊發(fā)射率低于1％，且基本保留生物活性，在滲透壓改變時(shí)刺絲囊發(fā)射率達(dá)80％以上。
　　2、本方法制備了不含水母自身組織雜質(zhì)的水母刺絲囊毒素。NNV有強(qiáng)心血管致死活性和溶血活性，分別較發(fā)形霞水母刺絲囊毒素(Cyanea capillata nematocyst venom，CNV)強(qiáng)20-

7、50倍和10-20倍。在越前水母刺絲囊(Nemopilema nomurai nematocyst，N3)中，松散刺絲等直徑型鉤刺絲囊毒素(O-isorhiza nematocyst venom，ONV)有強(qiáng)心血管致死活性，而刺絲漸細(xì)型鉤刺絲囊毒素(Anisorhizas nematocyst venom，ANV)并無致死活性，ONV的溶血活性略高。
　　3、通過對(duì)NNV凝膠純化各組分的初篩，確定了心血管毒素F和溶血毒素D這兩個(gè)組

8、分。F組分的心血管致死活性明顯高于NNV，約為NNV的5-10倍，且無溶血作用。D組分的溶血活性比NNV略低。
　　研究結(jié)論:
　　本研究首次依據(jù)對(duì)刺絲囊形態(tài)結(jié)構(gòu)的描述對(duì)不同類型刺絲囊進(jìn)行中文命名;通過分級(jí)沉降過濾，梯度密度離心的方法獲得大量純凈未發(fā)射的水母刺絲囊及單型刺絲囊，進(jìn)而獲得不含組織雜質(zhì)的水母刺絲囊毒素蛋白。相對(duì)于以往所制備毒素，本研究制備的純刺絲囊毒素的心血管毒性和溶血毒性均大大提高，且毒性穩(wěn)定。
　　本研

9、究重點(diǎn)優(yōu)化了越前水母刺絲囊的分離技術(shù)，得到了兩種越前水母單型刺絲囊Anisorhizas和O-isorhiza，通過對(duì)以上兩種刺絲囊的活性檢測(cè)，定位越前水母的心血管（致死）毒素主要存在于O-isorhiza中，兩種刺絲囊均含有溶血毒素。證明O-isorhiza是越前水母觸手具有主要攻擊功能的刺絲囊。本研究還對(duì)越前水母毒素蛋白進(jìn)行了初步分離純化，得到了具有明確溶血活性和心血管活性的純化組分，純化組分電泳條帶相對(duì)單一，性質(zhì)穩(wěn)定，可以用于下一

10、步結(jié)構(gòu)鑒定與機(jī)制研究。
　　本課題組前期研究及其他文獻(xiàn)報(bào)道都指出，水母毒素中穿孔機(jī)制可能是其造成溶血作用和心血管作用，甚至致死的原因。通過對(duì)越前水母單型刺絲囊毒素之間，以及純化組分D與F之間的活性比較，聯(lián)合電泳蛋白條帶的分析，可以確定:雖然越前水母NNV的溶血活性可能致死動(dòng)物，但嚴(yán)重的心血管致死效應(yīng)與溶血效應(yīng)這兩者之間無關(guān)聯(lián)性，是兩類不同的蛋白造成了這兩種毒性反應(yīng)。
　　由于心血管毒素F和溶血毒素D均為電泳檢測(cè)含有3-4個(gè)條