嗜線蟲致病桿菌Txp40蛋白毒素的分離純化及作用靶標(biāo)的研究.pdf

1、Txp40蛋白是昆蟲病原線蟲共生菌——嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)產(chǎn)生的一種具有血腔注射殺蟲活性的毒素，編碼該毒素的txp40基因廣泛存在于多種昆蟲病原線蟲共生菌中，具有很強的保守性。為了明確該毒素的殺蟲機理及其在共生菌致病過程中所起的作用，探索其開發(fā)應(yīng)用的潛力，本實驗以X.nematophila HB310菌株為材料，首先通過鹽析和非變性凝膠電泳native-PAGE方法以及原核表達(dá)的方法獲得此蛋白

2、，然后通過免疫共沉淀的方法尋找其作用靶標(biāo)。實驗結(jié)果如下。
　　1.利用85％飽和硫酸銨鹽析的方法獲得X.nematophila HB310菌液細(xì)胞內(nèi)總蛋白，然后通過制備型非變性電泳8％native-PAGE方法從中分離純化Txp40蛋白，回收的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明回收的蛋白為單一的約40 KDa蛋白條帶，將其注射5齡大蠟螟幼蟲，致死迅速，蟲體頭胸部黑化。回收蛋白與Txp40抗體進(jìn)行點雜交檢測，出現(xiàn)陽性反應(yīng)。這

3、些實驗結(jié)果表明回收的蛋白為具有殺蟲活性的Txp40蛋白毒素。
　　2.為了得到大量的的Txp40蛋白，從X.nematophila HB310中克隆了txp40基因，構(gòu)建了pET28a-txp40重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出42kD左右的蛋白，和預(yù)測的重組蛋白分子量一致。對目的蛋白進(jìn)行Western bloting鑒定，證實誘導(dǎo)表達(dá)的42kD蛋白為Txp40蛋白，生物測定結(jié)果表明重組Txp4

4、0蛋白對大蠟螟幼蟲具有血腔注射活性。
　　3.為了解Txp40蛋白的殺蟲機理，利用免疫共沉淀方法檢測Txp40蛋白在大蠟螟幼蟲體內(nèi)的靶標(biāo)互作蛋白，首現(xiàn)提取大蠟螟5齡幼蟲的總蛋白，利用Pierce(@)Co-Immunoprecipitation試劑盒與Txp40蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，將洗脫下來的特異性蛋白通過SDS(--)PAGE電泳進(jìn)行檢測，獲得分子量分別在200 kDa、100 kDa、60 kDa、40kDa、35 kDa處的