Xenorhabdus budapestensis D43菌株殺蟲蛋白的分離純化及致病機理的研究.pdf

1、昆蟲病原線蟲共生菌是一種重要的微生物資源，它能夠產(chǎn)生多種具有殺蟲、抑菌、抗腫瘤等功能的代謝產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域顯示出巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。特別是昆蟲病原線蟲共生菌能夠產(chǎn)生多種殺蟲蛋白，不僅可以直接作為蛋白質(zhì)農(nóng)藥，而且能夠為轉(zhuǎn)基因抗蟲植物和殺蟲工程菌株的發(fā)展提供更多新穎的基因資源。本研究以從中國東北土壤樣品獲得的擬雙角斯氏線蟲中分離的共生菌Xenorhabdusbudapestensis D43為試驗材料，對該菌株細胞內(nèi)的蛋白進

2、行了純化和篩選，并對篩選到具有殺蟲活性的蛋白進行了鑒定、基因克隆、序列生物信息學(xué)分析、重組蛋白的表達和純化，以及致病機理等方面的研究，得出主要研究結(jié)果如下：
　　 1、昆蟲病原線蟲共生菌X.budapestensis D43菌株細胞內(nèi)含有大量的蛋白種類，本研究利用制備型凝膠電泳的方法成功純化到4種，其中一種對大蠟螟幼蟲具有血腔注射活性，命名為HIP57。生物測定結(jié)果顯示，該蛋白對5齡大蠟螟幼蟲的LD50為206.81ng/頭；當(dāng)

3、以不低于490ng/頭的劑量注射時，試蟲體色會在15min之內(nèi)變黑，48h死亡率為100％。
　　 2、經(jīng)過雙向電泳分析和質(zhì)譜鑒定，HIP57的分子量約為60kDa，等電點4～5，與GroEL蛋白具有較高同源性。GroEL雖為分子伴侶，但在本研究中，來自于共生菌X。budapestensis D43菌株的HIP57顯示出殺蟲功能。克隆獲得HIP57基因全長1647bp(GenBank accession no.JN863588)

4、，編碼548個氨基酸殘基(GenBank accession no。AEU10771)。
　　 3、生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，HIP57蛋白的相對分子量為57379.7Da，理論等電點為4.77，與電泳結(jié)果相吻合；該蛋白序列中不含信號肽，屬于穩(wěn)定的水溶性蛋白；同時采用4種不同的預(yù)測原理分析了HIP57的二級結(jié)構(gòu)，特別是運用同源模建構(gòu)建了精確度較高的HIP57蛋白三級結(jié)構(gòu)；通過HIP57蛋白與其他4種同樣來源于昆蟲病原線蟲共生菌的G

5、roEL蛋白進行序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白擁有一些特有的氨基酸殘基；根據(jù)GroEL蛋白氨基酸序列的同源性，本研究成功構(gòu)建了43種腸桿菌科細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，將X.budapestensis D43聚類至致病桿菌屬，顯示出GroEL蛋白序列具有在細菌分類學(xué)和進化學(xué)應(yīng)用的潛在性。
　　 4、對HIP57、GFP和HIP57-GFP進行了原核表達，同時獲得了純度較高的3種重組蛋白。經(jīng)western blotting分析，這些重組蛋白與其相應(yīng)的

6、抗體都能夠發(fā)生特異性結(jié)合。與天然HIP57蛋白引起試蟲通體黑化現(xiàn)象和高致死活性相比，HIP57和GFP重組蛋白沒有顯示出這樣的功能；而HIP57-GFP重組蛋白雖不對試蟲具有致死活性，但是能夠引起試蟲體內(nèi)出現(xiàn)大量的黑色結(jié)節(jié)。
　　 5、HIP57蛋白對大蠟螟幼蟲致病機理的研究結(jié)果包括：其一，HIP57能夠引起大蠟螟幼蟲強烈的免疫反應(yīng)，包括PO活力顯著升高，血細胞數(shù)量顯著降低，以及血細胞包囊反應(yīng)；其二，大蠟螟注射HIP57后，有2

7、3種血淋巴蛋白的表達量發(fā)生顯著變化，其中4種獲得成功鑒定，分別為ApoLp-Ⅲ、Serpin、P27K和GST；其三，捕獲2種與HIP57具有潛在結(jié)合作用的血淋巴蛋白，分別為芳基貯存蛋白和β-1，3-葡聚糖識別蛋白前體。
　　 雖然在昆蟲病原線蟲共生菌復(fù)合體侵染寄主昆蟲過程中，HIP57是否被分泌的問題本研究未能給出答案，但HIP57顯示出非常高的致病性，如果在昆蟲病原線蟲共生菌復(fù)合體致病過程中能夠被分泌到寄主血腔中，應(yīng)為一種重