α-amanitin的分離鑒定及其致病機(jī)理研究.pdf

1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文αamanitin的分離鑒定及其致病機(jī)理研究姓名：趙建申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：楊志榮20040501四川大學(xué)博士學(xué)位論文pGAT10測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的GSTAT融合基因相位正確，閱讀框通讀。通過(guò)對(duì)融合基因在大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化，目的融合蛋白的表達(dá)量可提高33.5%，占總蛋白表達(dá)量的28.3%。這為利用化學(xué)手段環(huán)化aamanitin線性前體以及通過(guò)培養(yǎng)毒草菌絲體生產(chǎn)活性aamanitin的進(jìn)一步研

2、究提供了碳骨架來(lái)源，有助于對(duì)活性aamanitin的研究與生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)aamanitin致小鼠中毒機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，aamanitin腹腔和尾靜脈注射(給藥劑量范圍分別是0.60.9mgkg和0.25^0.45mgkg)兩種給藥方式下，小鼠死亡事件主要發(fā)生在給藥后24h60h時(shí)間段，小鼠死亡率概率變換值對(duì)給藥濃度對(duì)數(shù)變換值存在回歸關(guān)系，直線回歸方程分別為Y=0.0404X0.1297(R2=0.9662)和Y=0.0933X0.4878(R

3、2=0.9625)，半致死計(jì)量分別為0.742mgkg和0.327mgkgo尾靜脈給藥與腹腔注射相比，aamanitin作用的起效時(shí)間更快，強(qiáng)度更高，說(shuō)明中毒癥狀、死亡率與高水平的血藥濃度有關(guān)。aamanitin中毒會(huì)引起小鼠嚴(yán)重的腸胃炎反應(yīng)和小鼠體重的急劇降低。在尾靜脈給藥1296h時(shí)間段，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白濃度也顯著降低。其中WBC小細(xì)胞計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)與白細(xì)胞計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)相似，而WBC大細(xì)胞計(jì)數(shù)在尾靜脈給藥12h后，就一

4、直顯著性降低，占白細(xì)胞總數(shù)的比例持續(xù)降低。血清中BUN.Crea在給藥12h后明顯升高。24h后，ALT.AST含量分別為1308.51109.81UIL和898.0士197.99UfL，升高T24.0和9.64倍TBIL.DBIL含量分別為24.21士8.49pmoVL和17.74士7.25pmo1L，升高了26.3.40.0倍。TP.GLOB含量在給藥84h后顯著下降，Alb含量在給藥120h后顯著下降。中毒小鼠在48h后，肝臟和腎

5、臟的臟器指數(shù)升高。解剖和病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肝臟、腎臟病變嚴(yán)重超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，細(xì)胞核和線粒體是敏感的細(xì)胞器。利用反相HPLC技術(shù)分析動(dòng)物組織樣品中aamanitin的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尾靜脈給藥48h后，血漿和脾臟中不易檢測(cè)到aamanitin的存在，而在肝臟和腎臟中可以檢測(cè)到其存在。運(yùn)用MTT法研究不同濃度的aamanitin和不同作用時(shí)間對(duì)體外傳代培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞(Chang細(xì)胞株)和肝癌細(xì)胞(smmc7721細(xì)胞株)存活率的影響。研究