桑疫病致病菌的快速分離鑒定及其活體定量方法.pdf

1、由致病性桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv. mori)引起的桑疫病是我國一種嚴(yán)重的作物病害。由于缺乏有效的防控措施，該病害每年給我國造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。近年間，早期診斷技術(shù)作為植物病害防控的重要手段漸趨流行，通過對病原菌進(jìn)行早期檢測，提前預(yù)測病害疫情的嚴(yán)重性，從而制定合理有效的防治措施。
　　建立了一種快速篩選致病性桑丁香假單胞菌的方法。首先依據(jù)經(jīng)低溫處理之后的致病性桑丁香假單胞菌能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光效應(yīng)進(jìn)行

2、初篩，然后通過檢測特異性的hrpZ致病基因進(jìn)行復(fù)篩，最后根據(jù)回接驗(yàn)證，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和16S-rDNA分子生物學(xué)鑒定，從而得到Psm13-7、Psm14-1、Psm14-7、Psm15-2四株能引起典型桑疫病癥狀的致病菌株。整個分離篩選過程僅僅花費(fèi)15 d左右的時間，與傳統(tǒng)方法相比，分離時間縮短了近60天，分離效率提高了70％。該方法的成功構(gòu)建為丁香假單胞其他致病變種菌株的分離篩選提供可靠的參照依據(jù)。
　　利用特異性地引物對，構(gòu)建了致

3、病性桑丁香假單胞菌的熒光定量PCR檢測方法。通過將致病性桑丁香假單胞菌與其他致病變種的丁香假單胞菌進(jìn)行 hrpZ致病基因的差異性片段分析，設(shè)計(jì)篩選了一對適宜快速檢測致病性桑丁香假單胞菌的特異性引物對Psm240F/Psm434R。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明該引物對可從致病性桑丁香假單胞菌中擴(kuò)增出大小為195 bp的DNA片段，而對其他致病變種的丁香假單胞菌及其他種屬的病原菌均沒有擴(kuò)增。以致病性桑丁香假單胞菌全基因組 DNA和菌懸液分別

4、為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測，在6×10-5~6 ng/μL濃度范圍內(nèi)，DNA濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-3.22469x+14.03445,R2=0.99709，最低檢測限為60 fg/μL，在102~108CFU/mL濃度范圍內(nèi)，菌液濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-4.56215x+46.91167,R2=0.98872，最低檢測限為102CFU/mL。該方法的成功構(gòu)建為桑疫病的早期診斷提供了可靠

5、的技術(shù)支持。
　　利用疊氮溴化丙錠(PMA)耦合熒光定量PCR方法，構(gòu)建了致病性桑丁香假單胞菌的活體定量方法。通過對該致病菌細(xì)胞懸浮液進(jìn)行預(yù)處理，使用濃度為20ng/μL的PMA，黑暗孵育10 min，曝光10 min，可完全抑制濃度為108 CFU/mL死菌中的DNA，且不會對活菌 DNA的擴(kuò)增造成影響。在101~108 CFU/mL濃度范圍內(nèi)，PMA-qPCR的Ct值與菌濃的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-3.57193