鼻氣管鳥桿菌的分離鑒定及致病性研究.pdf

1、鼻氣管鳥桿菌（ORT）是一種不運(yùn)動(dòng)、高度多形性、無芽孢的革蘭氏陰性(G-)小桿菌。在血液瓊脂上生長(zhǎng)緩慢，5％-10％CO2條件下，于5％綿羊血液瓊脂37℃恒溫培養(yǎng)24h后可形成針尖大小、不溶血的灰白色圓形菌落。培養(yǎng)48h后可形成圓形、灰色到灰白色奶酪狀的直徑為1-3mm的小菌落，有時(shí)顏色稍變淺紅并發(fā)出類似酪酸的氣味。臨床上以呼吸道癥狀、生長(zhǎng)障礙、死亡率增加為特征，病理上以嚴(yán)重的單側(cè)或雙側(cè)纖維素性化膿性肺炎、氣囊炎為特征。目前，該病在歐洲

2、、美洲、南非的許多發(fā)達(dá)國(guó)家流行，并呈上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，因此，應(yīng)引起人們的廣泛注意。我國(guó)陳小玲等首次在國(guó)內(nèi)分離到2株ORT，但是還未見從山東省分離到該菌的報(bào)道，本課題應(yīng)用生化試驗(yàn)和PCR方法首次從山東省的商品肉雞中分離到5株ORT，并通過不同途徑感染雛雞，探討ORT對(duì)雛雞的致病性和體內(nèi)抗原的分布，為更好的控制本病提供理論依據(jù)。
　　 本研究采集山東省不同地區(qū)有呼吸道癥狀的病死雞進(jìn)行鼻氣管鳥桿菌（ORT）的分離，根據(jù)

3、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)和玻片凝集試驗(yàn)對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定。應(yīng)用PCR方法對(duì)分離菌株16S rRNA基因的一段保守序列進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)（AGP）對(duì)分離菌株的血清型進(jìn)行鑒定，并對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)共分離到5株ORT，所有分離菌株均能擴(kuò)增到一段671bp的特異性片段，而陰性對(duì)照菌株的擴(kuò)增結(jié)果為陰性；5株ORT分離菌株可分為3個(gè)血清型，其中血清A型3株，血清B型1株，血清D型1株；分離ORT菌株對(duì)羥氨芐青霉素、頭孢曲松、丁胺卡那

4、、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星高度敏感。選擇1株血清A型ORT分離菌株分別通過氣管、消化道和肌肉注射接種途徑人工感染肉雛雞和SPF雛雞，觀察試驗(yàn)雞的發(fā)病情況及癥狀，稱量各試驗(yàn)組和對(duì)照組的增重；利用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組排菌情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察；于感染后不同時(shí)間隨機(jī)剖殺試驗(yàn)組和對(duì)照組雞只，采集心臟、肝臟、肺臟和氣管等組織固定、切片、H.E.染色，觀察各器官病理組織學(xué)變化，利用建立的IFA方法對(duì)ORT在雛雞體內(nèi)的分布進(jìn)行研究，并進(jìn)

5、行血常規(guī)和血液生化指標(biāo)檢測(cè)。ORT接種后，引起雛雞的呼吸困難、咳嗽等癥狀，增重明顯降低；病理組織學(xué)變化以肝臟、心臟組織細(xì)胞變性、壞死，氣管和肺臟廣泛性出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征；IFA陽性信號(hào)主要分布于肺臟和氣管；從感染后的第2d到第8d一直可持續(xù)排菌；HGB、WBC、RBC、BUN和AST發(fā)生顯著變化。以1株ORT分離株免疫清潔級(jí)新西蘭白兔，高免血清經(jīng)辛酸-硫酸銨法和葡聚糖G200柱純化，制得第一抗體。以FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG為第

6、二抗體，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了ORT間接免疫熒光（IFA）快速診斷方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：一抗的最佳稀釋度為1:25，感作時(shí)間為4℃過夜，二抗的最佳工作濃度為1:200，感作時(shí)間為37℃1h，ORT特異性黃綠色熒光最清晰。應(yīng)用建立的IFA對(duì)ORT人工感染雛雞的各組織器官進(jìn)行檢測(cè)，氣管、肺臟、肝臟、心臟均可檢測(cè)到ORT，其中氣管和肺臟檢出率最高，表明這兩個(gè)器官是ORT的主要靶器官。研究表明本法用于ORT的診斷具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)