耐堿蛋白A的表達(dá)及相關(guān)蛋白的分離純化研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)能夠與免疫球蛋白特異性結(jié)合，廣泛用于抗體的檢測(cè)和純化。由于蛋白A親和介質(zhì)價(jià)格昂貴，需要在整個(gè)純化過(guò)程中插入在位清洗(cleaning-in-place，CIP)步驟用于去除樣品中的各種污染物以延長(zhǎng)層析介質(zhì)的生命周期。NaOH(0.1-0.5 mol/L)目前是CIP步驟最有效的清潔劑。國(guó)內(nèi)關(guān)于此方面的研究較少，急需建立耐堿蛋白A的國(guó)產(chǎn)化技術(shù)體系以滿足當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)耐堿蛋白A的需求。本論文的主要內(nèi)容之一就是在設(shè)計(jì)

2、耐堿蛋白A序列并優(yōu)化耐堿蛋白A表達(dá)過(guò)程的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究耐堿蛋白A的分離純化流程，旨在以較小成本獲得更高純度的目的產(chǎn)物。另外，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并成功表達(dá)的融合蛋白AG(Chimeric Protein AG，CPAG)，可彌補(bǔ)蛋白A與IgG3結(jié)合能力較弱的缺點(diǎn)。本論文進(jìn)一步研究其分離純化技術(shù)以提高CPAG的純度和回收率，并降低成本。本論文的研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)部分:
　　(1)耐堿蛋白A的基因構(gòu)建與表達(dá)優(yōu)化。設(shè)計(jì)出表達(dá)耐堿蛋白A的序列

3、，并確定了耐堿蛋白A表達(dá)菌株大腸桿菌BL21培養(yǎng)5h后使用濃度為0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)5h為搖瓶表達(dá)優(yōu)化的最終方案。
　　(2)耐堿蛋白A的分離純化研究。優(yōu)化后的初分離純化方案是:首先使用含60 mMNaCl，25 mM pH8.0 Tris-HCl加溶菌酶裂解破碎大腸桿菌，再80℃加熱處理10 min，然后用終濃度為0.13％(w/v)的聚乙烯亞胺(PEI)沉淀等。DEAE弱陰離子交換層析選擇的條件為:

4、采用線性洗脫梯度為5％ B～25％B，10 CV。經(jīng)過(guò)DEAE一步柱層析，耐堿蛋白A的純度就能達(dá)到93％以上。最后，對(duì)獲得的耐堿蛋白A產(chǎn)品的抗堿性以及IgG結(jié)合能力等進(jìn)行了初步的檢測(cè)。在0.05 M NaOH溶液中，蛋白A隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯降解的現(xiàn)象，而耐堿蛋白A經(jīng)過(guò)了24 h仍能保持比較穩(wěn)定。在0.5 M NaOH溶液中6h之后，普通蛋白A已經(jīng)完全降解，而仍有部分耐堿蛋白A保持完整，電泳顯示為單條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，耐堿蛋白A對(duì)堿性條

5、件的穩(wěn)定性要優(yōu)于蛋白A，并且其親和介質(zhì)IgG結(jié)合能力在堿性條件下較穩(wěn)定。耐堿蛋白A親和吸附劑對(duì)人IgG的動(dòng)態(tài)結(jié)合容量是相同配基密度的蛋白A吸附劑的兩倍以上。耐堿蛋白A吸附劑對(duì)人IgG的親和常數(shù)為1.2×105 L/mol，平衡解離常數(shù)為1.31 mg/mL，最大理論結(jié)合容量為72.84 mg/mL。
　　(3) CPAG的分離純化研究。優(yōu)化后的純化方案依次包括:溶菌酶輔助超聲破碎大腸桿菌，80℃熱處理20 min，終濃度為0.10