靶向白血病干細(xì)胞新單抗3A4的人源化研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　白血病居小兒惡性腫瘤發(fā)病和死亡的首位。目前在中國(guó)有200多萬(wàn)的白血病患兒，且新發(fā)病例在不斷增加。雖然近年來(lái)不斷優(yōu)化治療方案，但仍有部分患兒治療失敗。其中白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell，LSC)的殘留被認(rèn)為是白血病耐藥和復(fù)發(fā)的根源。單克隆抗體（單抗）導(dǎo)向的免疫治療因其對(duì)靶細(xì)胞具有高度特異性和有效殺傷性而成為目前研究的熱點(diǎn)。如果能找到靶向LSC的新單抗，則白血病的治療和預(yù)后將會(huì)有新的突破。

2、r>　　CD45RA在髓系和B系惡性血液病細(xì)胞及LSC上高表達(dá)，而在中性粒細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞及記憶T細(xì)胞上不表達(dá)，故CD45RA可作為殺傷LSC的一個(gè)良好靶點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期已成功研制抗人CD45RA的鼠單抗3A4及人鼠嵌合抗體scFv3A4-Fc，然而鼠及人鼠嵌合抗體作為異種抗原易引發(fā)人抗鼠抗體或人抗嵌合抗體反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低鼠源抗體的免疫原性，需要對(duì)其Fab段也進(jìn)行人源化改造。由于用傳統(tǒng)方法篩選人源化抗體費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故本

3、研究的目的包括獲取高親和力人源化抗體Hu3A4，同時(shí)積極探索出一種簡(jiǎn)便快捷地進(jìn)行人源化抗體篩選的新方法。另外，探索構(gòu)建新的免疫毒素以增強(qiáng)抗體的靶向殺傷特性也是本研究的目的之一。
　　本研究包括三個(gè)部分:1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究;2.高親和力人源化抗體的篩選及功能研究;3.人鼠嵌合抗體免疫毒素(scFv3A4-FcRap)的制備及活性研究。
　　

4、方法：
　　1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究
　　1.1 scFv3A4-EGFP融合蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增EGFP基因，將該基因插入pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中構(gòu)建pcDNA3.1/EGFP質(zhì)粒，然后酶切替換pHMCH3/scFv3A4-Fc中Fc段從而構(gòu)建出pHMCH3/scFv3A4-EGFP真核表

5、達(dá)載體。
　　1.2 scFv3A4-EGFP融合蛋白的表達(dá)和活性檢測(cè)
　　1)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，以pHMCH3/scFv3A4-EGFP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)G418加壓篩選。
　　2)加壓篩選14天左右，RT-PCR，細(xì)胞免疫熒光，流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。
　　3)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行單克隆化，熒光顯微鏡觀(guān)察法篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，命名為CHO/scFv3A4-EGFP，同時(shí)用RT-PCR方法探索

6、亞克隆出現(xiàn)假陰性原因。
　　4)收集上清，Ni-IDA親和層析法純化scFv3A4-EGFP融合蛋白，BCA法測(cè)定融合蛋白濃度。
　　5) SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中scFv3A4-EGFP融合蛋白的表達(dá)，并確定分子量大小。
　　6)滴定實(shí)驗(yàn)初步了解scFv3A4-EGFP融合蛋白的親和力。
　　7)抗體阻滯實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞表達(dá)譜研究確定scFv3A4-EGFP融合蛋白抗原識(shí)別特異性。

7、
　　8)細(xì)胞免疫熒光法和BFA阻滯法確定scFv3A4-EGFP融合蛋白在CHO細(xì)胞中的分泌途徑。
　　9)熒光淬滅法以了解scFv3A4-EGFP融合蛋白的光穩(wěn)定性。
　　2.高親和力人源化抗體的篩選及功能研究
　　2.1人源化抗體的理論設(shè)計(jì)及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　1)人源化抗體的設(shè)計(jì)。首先將3A4的V及VL基因與人抗體庫(kù)基因序列進(jìn)行比對(duì)以確定人源化FR模板，將3A4的CDR植入該模板中構(gòu)建人源化3

8、A4VHa及3A4VLa基因。用Discovery Studio2.5軟件模擬3A4的三維結(jié)構(gòu)并確定關(guān)鍵氨基酸殘基位置，構(gòu)建回復(fù)突變的人源化3A4VHb及3A4VLb基因。
　　2)人源化抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建。為利于scFv-Fc形式蛋白的純化，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增pHMCH3/scFv3A4-Fc質(zhì)粒中Fc段，從而將6xHis標(biāo)簽引入，構(gòu)建新的scFv3A4-FcHis真核表達(dá)載體。全基因合成3A4VHa、3A4VLa、3A4V

9、Hb及3A4VLb基因。通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)方法構(gòu)建pGEM-T/scFv3A4a及pGEM-T/scFv3A4b質(zhì)粒，然后通過(guò)雙酶切構(gòu)建scFv3A4a-FcHis及scFv3A4b-FcHis真核表達(dá)載體。為驗(yàn)證scFv-EGFP融合蛋白可用于人源化抗體篩選，通過(guò)酶切方法構(gòu)建scFv3A4a-EGFP及scFv3A4b-EGFP真核表達(dá)載體。
　　2.2高親和力人源化抗體的表達(dá)與篩選
　　1)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

10、染的方法，以pHMCH3/scFv3A4-FcHis、 pHMCH3/scFv3A4a-FcHis、pHMCH3/scFv3A4b-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-EGFP及pHMCH3/scFv3A4b-EGFP轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后18小時(shí)熒光顯微鏡觀(guān)察融合蛋白的表達(dá)情況，24小時(shí)后G418加壓篩選。
　　2)收集轉(zhuǎn)染后24h，48h及72h細(xì)胞培養(yǎng)上清，流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)融合蛋白瞬時(shí)表達(dá)情況。加壓篩選14天左右

11、，RT-PCR檢測(cè)pHMCH3/scFv3A4a-FcHis及pHMCH3/scFv3A4a-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞株目的基因表達(dá)情況。
　　3)通過(guò)抗體阻滯實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)了解scFv3A4b-FcHis與scFv3A4b-EGFP的抗原識(shí)別情況和親和力。
　　2.3完整IgG形式高親和力人源化抗體Hu3A4真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　1)構(gòu)建人重鏈恒定區(qū)(CH)及輕鏈恒定區(qū)(CL) TA克隆載體。提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(P

12、BMC)總RNA，PCR法擴(kuò)增人CH及CL片段，構(gòu)建CH及CLTA克隆載體。
　　2)構(gòu)建人源化重鏈Hu3A4VH-CH真核表達(dá)載體
　　雙酶切pGEM-T/CH及pHMCH3/scFv3A4b-FcHis，將目的片段與載體片段連接后構(gòu)建Hu3A4VH-CH真核表達(dá)載體。
　　3)構(gòu)建人源化輕鏈Hu3A4VL-CL真核表達(dá)載體
　　通過(guò)PCR和雙酶切首先構(gòu)建pHMCH3/3A4VLb-FcHis質(zhì)粒，然后雙酶切C

13、LPCR產(chǎn)物及pHMCH3/3A4VLb-FcHis，連接后獲得Hu3A4VL-CL真核表達(dá)載體。
　　2.4完整IgG形式高親和力人源化抗體Hu3A4的表達(dá)和功能研究
　　1)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pHMCH3/Hu3A4VH-CH及pHMCH3/Hu3A4VL-CL共同轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)G418加壓篩選。
　　2)加壓篩選14天左右，RT-PCR，細(xì)胞免疫熒光，流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。
　

14、　3)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行單克隆化，熒光顯微鏡觀(guān)察法篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，命名為CHO/Hu3A4。
　　4)收集上清，SPA親和層析法純化Hu3A4，BCA法測(cè)定抗體濃度。
　　5) SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中Hu3A4的表達(dá)，并確定分子量大小。
　　6)滴定實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)了解并比較Hu3A4與scFv3A4b-FcHis的親和力。
　　7)CDC和ADCC實(shí)驗(yàn)了解并比較Hu3

15、A4與scFv3A4b-FcHis對(duì)靶細(xì)胞的殺傷特性。
　　8)觀(guān)察并比較Hu3A4與scFv3A4b-FcHis對(duì)白血病小鼠的治療情況。
　　3.人鼠嵌合抗體免疫毒素（scFv3A4-FcRap）的制備及活性研究
　　3.1 scFv3A4-FcRap免疫毒素真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　全基因合成Rap基因，通過(guò)PCR和雙酶切構(gòu)建scFv3A4-FcRap免疫毒素真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　3.2 scFv3A

16、4-FcRap免疫毒素的表達(dá)和功能研究
　　1)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pHMCH3/scFv3A4-FcRap轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)G418加壓篩選。
　　2)加壓篩選14天左右，RT-PCR，細(xì)胞免疫熒光，流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。
　　3)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行單克隆化，熒光顯微鏡觀(guān)察法篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，命名為CHO/scFv3A4-FcRap。
　　4)收集上清，Ni-IDA親和層析法純化scFv

17、3A4-FcRap，BCA法測(cè)定抗體濃度。
　　5) SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中scFv3A4-FcRap的表達(dá)，并確定分子量大小。
　　6)滴定實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)了解scFv3A4b-FcHis的親和力。
　　7)流式細(xì)胞儀檢測(cè)scFv3A4-FcRap對(duì)靶細(xì)胞的直接殺傷作用。
　　8)流式細(xì)胞儀檢測(cè)scFv3A4-FcRap的內(nèi)化作用。
　　9) CDC和ADCC實(shí)驗(yàn)

18、了解并比較scFv3A4-FcRap與scFv3A4-FcHis對(duì)靶細(xì)胞的殺傷特性。
　　10)觀(guān)察并比較scFv3A4-FcRap與scFv3A4-FcHis對(duì)白血病小鼠的治療情況。
　　結(jié)果：
　　1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究:成功構(gòu)建pcDNA3.1/EGFP和pHMCH3/scFv3A4-EGFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，加壓篩選14天左

19、右，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞Cdna可擴(kuò)增出目的條帶，細(xì)胞免疫熒光法檢查可見(jiàn)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞內(nèi)含有目的蛋白。流式細(xì)胞儀分析法在轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到有活性的scFv3A4-EGFP融合蛋白，陽(yáng)性細(xì)胞率為85.82％，經(jīng)亞克隆后篩選到穩(wěn)定表達(dá)株CHO/scFv3A4-EGFP。對(duì)假陰性細(xì)胞株進(jìn)行RT-PCR法證實(shí)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。擴(kuò)大培養(yǎng)CHO/scFv3A4-EGFP后取上清檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞率可達(dá)97％以上。Ni-IDA親和層析

20、法純化scFv3A4-EGFP融合蛋白，BCA法測(cè)濃縮純化蛋白為0.135mg/ml，CHO/scFv3A4-EGFP細(xì)胞培養(yǎng)上清濃度約為1350μg/L。SDS-PAGE和Western-Blot鑒定scFv3A4-EGFP分子量約57KDa。滴定實(shí)驗(yàn)顯示約0.1μg scFv3A4-EGFP即可飽和1×106KGla細(xì)胞。抗體阻滯實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞表達(dá)譜研究證實(shí)scFv3A4-EGFP融合蛋白與親本3A4抗體識(shí)別相同的抗原表位。細(xì)胞免疫熒光

21、法和BFA阻滯法證實(shí)scFv3A4-EGFP融合蛋白在CHO細(xì)胞中通過(guò)高爾基復(fù)合體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑進(jìn)行分泌。熒光淬滅法證實(shí)scFv3A4-EGFP融合蛋白有良好的光穩(wěn)定性。
　　2.高親和力人源化抗體的篩選:根據(jù)人源化比對(duì)結(jié)果選擇同源性最高的序列X62106及X86355作為3A4VH人源化模板序列;選擇M23090及AF103571作為3A4VL人源化模板序列。用軟件確定3A4中14個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)（注:由于相關(guān)位點(diǎn)正準(zhǔn)備申請(qǐng)專(zhuān)利故

22、不詳述，請(qǐng)各位專(zhuān)家諒解）。成功構(gòu)建pHMCH3/scFv3A4-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-FcHis、pHMCH3/scFv3A4b-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-EGFP及pHMCH3/scFv3A4b-EGFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞18小時(shí)后即可用熒光顯微鏡觀(guān)察到含EGFP片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可發(fā)出綠色熒光。流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到轉(zhuǎn)染后24h，48h及72h細(xì)胞培養(yǎng)上清中scFv3A4-FcHis、scFv

23、3A4b-FcHis、scFv3A4-EGFP及scFv3A4b-EGFP融合蛋白的表達(dá)，且蛋白分泌量隨著時(shí)間的增加而增多。加壓篩選14天左右，RT-PCR檢測(cè)pHMCH3/scFv3A4a-FcHis及pHMCH3/scFv3A4a-EGFP轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞cDNA可擴(kuò)增出目的條帶。抗體阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)scFv3A4b-FcHis與scFv3A4b-EGFP識(shí)別相同的抗原表位，而競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明scFv3A4b-FcHis與scFv3A

24、4b-EGFP有相近的親和力。
　　3.完整IgG形式高親和力人源化抗體Hu3A4的制備及功能研究:成功構(gòu)建pHMCH3/Hu3A4VH-CH和pHMCH3/Hu3A4VL-CL質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，加壓篩選14天左右，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞cDNA可擴(kuò)增出目的條帶，細(xì)胞免疫熒光法檢查可見(jiàn)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞內(nèi)含有目的蛋白。經(jīng)亞克隆后篩選到穩(wěn)定表達(dá)株CHO/Hu3A4，取上清檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞率可達(dá)98％以上。SPA親和層析法純化

25、Hu3A4抗體，BCA法測(cè)濃縮純化蛋白為0.25mg/ml，推測(cè)CHO/Hu3A4細(xì)胞培養(yǎng)上清濃度約為2.50μg/ml。SDS-PAGE和Western-Blot鑒定Hu3A4分子量約160 kDa。滴定實(shí)驗(yàn)顯示約0.5μg Hu3A4或1.0μg的scFv3A4b-FcHis抗體即可飽和1×106KGla細(xì)胞。Hu3A4的相對(duì)親和力為3.7×1010M-1，而scFv3A4b-FcHis為4.7×109M-1。Hu3A4及scFv3

26、A4b-FcHis的CDC作用均不明顯，而ADCC作用隨效靶比的增高而增強(qiáng)，并且Hu3A4的ADCC作用強(qiáng)于scFv3A4b-FcHis。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示Hu3A4及scFv3A4b-FcHis均可有效治療白血病小鼠。
　　4.scFv3A4-FcRap免疫毒素的制備和功能研究:成功構(gòu)建pHMCH3/scFv3A4-FcRap質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，加壓篩選14天左右，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞cDNA可擴(kuò)增出目的條帶，細(xì)胞免疫熒

27、光法檢查可見(jiàn)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞內(nèi)含有目的蛋白。經(jīng)亞克隆后篩選到穩(wěn)定表達(dá)株CHO/Hu3A4，取上清檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞率可達(dá)98％以上。Ni-IDA親和層析法純化scFv3A4-FcRap免疫毒素，BCA法測(cè)濃縮純化蛋白為1.5mg/ml，推測(cè)CHO/scFv3A4-FcRap細(xì)胞培養(yǎng)上清濃度約為4-5μg/ml。 SDS-PAGE和Western-Blot鑒定scFv3A4-FcRap分子量約135 kDa。滴定實(shí)驗(yàn)顯示約0.25μg scFv

28、3A4-FcRap即可飽和1×106KGla細(xì)胞。ScFv3A4-FcRap的相對(duì)親和力為5.0×1010M-1。 ScFv3A4-FcRap在體外對(duì)KGla細(xì)胞有一定的直接殺傷作用。ScFv3A4-FcRap及scFv3A4-FcHis的CDC作用均不明顯，而ADCC作用隨效靶比的增高而增強(qiáng)，并且scFv3A4-FcRap的ADCC作用與scFv3A4-FcHis抗體相當(dāng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示scFv3A4-FcRap及scFv3A4-FcH

29、is均可有效治療白血病小鼠。
　　結(jié)論：
　　1、證實(shí)CHO細(xì)胞可穩(wěn)定地表達(dá)和分泌抗CD45RA的scFv3A4-EGFP融合蛋白，該表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)該也可以用于其他的scFv-EGFP融合蛋白的表達(dá)。
　　2、開(kāi)發(fā)了一種新的方法（構(gòu)建人源化scFv-EGFP融合蛋白）以加快抗體的人源化篩選過(guò)程。該方法結(jié)合計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)可顯著縮短治療性抗體的開(kāi)發(fā)時(shí)間。
　　3、成功構(gòu)建并獲得3A4的兩種形式人源化抗體scFv3A4