免疫毒素IL-18-PE38融合基因重組載體構(gòu)建及其在疾病治療中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的： 構(gòu)建免疫毒素IL-18-PE38融合基因真核表達(dá)重組載體，并研究該重組質(zhì)粒對IL-18受體超表達(dá)的白血病及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是否有治療作用。 方法與結(jié)果： (1)通過限制性內(nèi)切酶雙酶切從質(zhì)粒PRKL459K-IL18-PE38中獲取IL-18-PE38融合基因，將其與分泌性真核表達(dá)載體pSecTag2B連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，挑取單克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，EcoRI單酶切后電泳鑒定顯示所構(gòu)建真核表達(dá)載體pSec

2、Tag2B-IL-18-PE38片段長度約為6.8kb。DNA測序結(jié)果顯示IL-18和PE38序列與基因文庫中報(bào)道序列相符。 (2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入3T3細(xì)胞，熒光免疫細(xì)胞化學(xué)法熒光顯微鏡照片顯示轉(zhuǎn)染融合基因組熒光表達(dá)強(qiáng)，空載體對照組熒光表達(dá)微弱。轉(zhuǎn)染之3T3細(xì)胞用Zeocin篩選純系轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，篩選50天后，空白組細(xì)胞死亡，對照組與轉(zhuǎn)染組存活細(xì)胞成克隆性生長。采用斑點(diǎn)ELLSA和Western-blo

3、t法鑒定細(xì)胞培養(yǎng)上清，證實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中有融合蛋白表達(dá)。將上清作用于白血病L615細(xì)胞株，MTT法測定細(xì)胞生長情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組基因組細(xì)胞死亡率高于轉(zhuǎn)染空載體對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示轉(zhuǎn)染重組基因組可見明顯凋亡峰。AO/EB熒光雙染色熒光顯微鏡照片顯示轉(zhuǎn)染組較對照組呈現(xiàn)明顯凋亡細(xì)胞染色特征。 (3)小鼠原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，采用Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，結(jié)果顯示胞漿陽性。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠軟骨細(xì)胞

4、中，分別設(shè)置空載體對照，通過熒光免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定，熒光顯微鏡照片顯示轉(zhuǎn)染融合基因組熒光表達(dá)強(qiáng)，空載體對照組熒光表達(dá)微弱。 結(jié)論： (1)重組毒素IL-18-PE38融合基因真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 (2)重組毒素IL-18-PE38融合基因在NIH3T3細(xì)胞中成功表達(dá)，并可分泌蛋白出胞外，且此融合毒素對L615細(xì)胞有促凋亡作用。提示此重組免疫毒素可望在白血病治療中發(fā)揮作用。 (3)成功建立原代小鼠