hTERT啟動(dòng)子調(diào)控PE38KDEL基因載體的構(gòu)建及其在MiaPaCa2細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的： 人胰腺癌是臨床常見(jiàn)高度惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，手術(shù)可切除率在10％左右，以手術(shù)為主的綜合治療手段效果不好，術(shù)后轉(zhuǎn)移早，其中位生存時(shí)間不足5個(gè)月，五年生存率小于5％；而在不可切除的病例中，化療和放療副反應(yīng)大。因此，提高治療效果，探索胰腺癌的基因治療有重要意義。然而基因治療的療效并不令人滿意，原因是多方面的，其中轉(zhuǎn)移基因在靶細(xì)胞組織或器官中表達(dá)的時(shí)空特異性、基因治療載體的安全性等問(wèn)題嚴(yán)重影響了此項(xiàng)工作的進(jìn)展。

2、 端粒酶是一個(gè)核糖蛋白復(fù)合體，它的功能是給染色體末端加入重復(fù)序列（TTAGGG）n，眾所周知，它在細(xì)胞永生化中發(fā)揮著重要作用。端粒酶在很多腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)陽(yáng)性，而在正常細(xì)胞端粒酶則呈陰性。在端粒酶3個(gè)必需組成部分中，端粒酶催化亞單位（telomerase catalytic subunit，hTERT）只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，利用hTERT啟動(dòng)子調(diào)控目的基因靶向表達(dá)有望成為靶向基因治療的重要手段。 銅綠假單胞菌外毒素（Pseud

3、omonas exotoxin A，PE）是由銅綠假單胞菌分泌，分子量約為66000的一條單鏈多肽，由613個(gè)氨基酸組成，其毒性強(qiáng)烈。PE作為新型的導(dǎo)向性藥物－免疫毒素（Immunotoxins，ITs）的毒素分子在生物治療中顯示了其良好的殺傷效果。PE38KDEL是截短了的PE，其分子量較PE小，免疫原性較PE低，其毒性較較PE提高了6～10倍。 以PE38KDEL毒素為“導(dǎo)彈”，以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Human Telomer

4、ase Reverse Transcriptase，hTERT）啟動(dòng)子為腫瘤靶向啟動(dòng)子，構(gòu)建真核表達(dá)載體phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP，使EGFP和PE38KDEL在具有端粒酶活性的人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa2中特異性表達(dá)。 方法： 從含hTERT啟動(dòng)子序列的重組質(zhì)粒pGL3-hTERTp上，PCR得到約280 bp的核心啟動(dòng)子片段，以之取代pIRES2-EGFP中的CMV啟動(dòng)子，然后將PE38K

5、DEL亞克隆到pHTERT-IRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn)（MCS）中，構(gòu)建phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP真核表達(dá)載體。用含有巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子的質(zhì)粒pIRES2-EGFP作為陽(yáng)性對(duì)照，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa2，人胚肺成纖維細(xì)胞Wi-38，熒光顯微鏡下觀察各細(xì)胞中EGFP轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。 結(jié)果： 雙酶切及測(cè)序均證實(shí)真核表達(dá)載體phTERTp-PE38KEDL-IRE

6、S2-EGFP構(gòu)建成功。細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染了pIERS2-EGFP質(zhì)粒的MiaPaCa2、Wi-38、細(xì)胞中EGFP都有不同程度的表達(dá)：轉(zhuǎn)染phTERTp-PE38KEDL-IRES2-EGFP質(zhì)粒的MiaPaCa2人胰腺癌細(xì)胞中可清晰地觀察到EGFP強(qiáng)熒光表達(dá)，而Wi-38細(xì)胞中無(wú)熒光表達(dá)。 結(jié)論： hTERT啟動(dòng)子能調(diào)控PE38KDEL及EGFP在胰腺癌細(xì)胞特異性表達(dá)。CMV啟動(dòng)子調(diào)控的EGFP在胰腺癌細(xì)胞和正