截短的銅綠假單胞菌外毒素（PE38KDEL）在大腸桿菌中的表達(dá)及其生物學(xué)活性的研究.pdf

1、目的： 銅綠假單胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin A，PE)是銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeurihinosa，PA)分泌的一種致病物質(zhì)。：PE為一條單鏈多肽，能抑制真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自上世紀(jì)80年代中期以來，PE及其它一些植物的或細(xì)菌的毒素被用來與抗體、細(xì)胞因子、多肽類激素等偶聯(lián)，而成為免疫毒素(Immunotoxins，ITs)，用以殺傷帶有相應(yīng)抗原或受體的靶細(xì)胞。目前已有多

2、種PE類免疫毒素進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，尤其在腫瘤治療方面取得了顯著的療效：但是在動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中，ITs亦表現(xiàn)出非特異性毒性，如導(dǎo)致發(fā)熱、寒顫、血管滲漏綜合癥、肝腎損傷等毒性反應(yīng)。普遍認(rèn)為毒素分子本身和作為導(dǎo)向分子的抗體或者細(xì)胞因子都有可能是引起非特異性毒性反應(yīng)的因素。故本研究擬構(gòu)建截短的．PE(PE38KDEL)的原核表達(dá)載體，進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)和純化，并檢測其對細(xì)胞的毒性活性，從而為進(jìn)一步改造毒素，降低非特異性毒性作用，為構(gòu)建更加有

3、效的免疫毒素提供高效低毒的毒素分子奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： (1)PE38KDEL的原核表達(dá)載體的構(gòu)建：從GenBank上獲取PE38KDEL基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，再利用PCR技術(shù)從原核表達(dá)質(zhì)粒pRK_L/IL18-PE38KDEL擴(kuò)增目的基因片段PE38KDEL。通過酶切及連接反應(yīng)將PE38KDEL克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1

4、/PE38KDEL。重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、PCR擴(kuò)增鑒定及DNA序列測定證實(shí)插入片段的正確性。 (2)GST-PE38KDEL融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)鑒定及活性測定：將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PE38KDEL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blot分別測定其大小和特異性。用GSTrapFF純化柱純化融合蛋

5、白GST-PE38KDEL。采用MTS比色法檢測融合蛋白對細(xì)胞的殺傷作用。 結(jié)果： (1)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、RCR擴(kuò)增及序列測定證實(shí)，截短的銅綠假單胞菌外毒素(PE38KDEL)的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，目的片段大小正確，定向插入的方向正確，目的基因的閱讀框架無改變。 (2)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PE38KDEL在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了PE38KDEL與GST的融合表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果

6、顯示表達(dá)產(chǎn)物的分子量大小與預(yù)期值一致，Western blot結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物可與兔抗PE多克隆抗體結(jié)合，在NC膜上顯示出一條與預(yù)期分子量一致的蛋白印跡條帶。上清可溶性蛋白經(jīng)GSTrap FF純化柱純化，純化產(chǎn)物行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示獲得單一的Mr約63 000的目的條帶。MTS比色法檢測細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示目的蛋白在作用濃度1～10μg/ml時對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞沒有或有輕微的殺傷作用，在100～1000 μg/ml殺傷作用顯著。

7、 結(jié)論： (1)成功構(gòu)建了截短的銅綠假單胞菌外毒素(PE38KDEL)的原核表達(dá)載體-pGEX-4T-1/PE38KDEL。 (2)pGEX-4T-1/PE38KDEL在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了高效的表達(dá)，經(jīng)純化得到了純度較高的融合蛋白。MTS比色法檢測結(jié)果顯示，融合蛋白GST-PE38KDEL在高濃度下對多種細(xì)胞具有強(qiáng)烈的殺傷作用。本研究結(jié)果為下一步改造毒素，降低其非特異性毒性，以構(gòu)建高效低毒的免疫毒