人NR4A1基因重組腺病毒載體構(gòu)建及其在多囊卵巢綜合征病理機(jī)制研究中的初步應(yīng)用.pdf

1、目的：NR4A1(又稱(chēng)Nur77、TR3或NGFI-B)是甾體激素/甲狀腺激素/類(lèi)維生素A受體超家族成員中的一員，其通常作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控基因的表達(dá)。在前期研究工作中，我們通過(guò)基因芯片雜交技術(shù)篩選出正常人和PCOS患者卵巢組織中290個(gè)差異表達(dá)的基因，NR4A1是該差異表達(dá)譜內(nèi)代表性基因之一，其在PCOS患者卵巢中表達(dá)下調(diào)(正常/PCOS=0.4)。既往大量的研究表明NR4A1在許多重要組織中均有表達(dá)，其功能涉及細(xì)胞凋亡/增殖、甾體激

2、素代謝、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等諸多方面。但是，有關(guān)NR4A1在PCOS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚未有過(guò)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建人NR4lAl基因重組腺病毒載體及小鼠卵泡體外培養(yǎng)的方法，實(shí)現(xiàn)NR4A1基因在小鼠卵泡膜細(xì)胞內(nèi)的超表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，觀察NR4lAl基因超表達(dá)對(duì)卵泡膜細(xì)胞雄激素生成的影響。該研究為我們進(jìn)一步探討NR4A1在PCOS復(fù)雜病理生理改變過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 方法：(1)周RT-PCR的方法從人卵巢組織中擴(kuò)增NR4A

3、1基因全長(zhǎng)，經(jīng)T/A克隆后，亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdtrack-NR4A1。pAdtrack-NR4Al經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，用PmeⅠ酶切使其線(xiàn)性化，然后通過(guò)“兩步轉(zhuǎn)化法”分別將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1和穿梭質(zhì)粒pAdtrack-NR4A1轉(zhuǎn)化至BJ-5183感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行同源重組得到AdCMV-NR4A1重組腺病毒質(zhì)粒。PacⅠ酶切線(xiàn)性化重組質(zhì)粒AdCMV-NR4A1后通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

4、染AD-293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增。AdCMV-NR4A1轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞2-3天后見(jiàn)GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染10～12 d后當(dāng)90％以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)，收集病毒上清。用收集的病毒上清再次感染AD-293細(xì)胞，重復(fù)感染四次，實(shí)現(xiàn)病毒大量擴(kuò)增。最后，取1μl病毒上清進(jìn)行PCR反應(yīng)驗(yàn)證上清中NR4A1基因的存在；抽提AdCMV-NR4A1感染的AD-293細(xì)胞蛋白，Western blot驗(yàn)證NR4A1蛋白的表達(dá)。 (2)從20

5、日齡小鼠卵巢中分離并挑選出200μm的卵泡，置于96孔板中進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時(shí)后挑選形態(tài)、色澤良好的卵泡轉(zhuǎn)移至新孔中，予AdCMV-NR4A1重組病毒直接加入卵泡培養(yǎng)液中感染卵泡膜細(xì)胞。病毒感染卵泡48小時(shí)后分別提取卵泡RNA及卵泡蛋白，通過(guò)RT-PCR及Western blot的方法驗(yàn)證NR4A1在卵泡膜細(xì)胞中的超表達(dá)。同時(shí)，收集卵泡的條件培養(yǎng)液，用超敏感的固相放射免疫方法檢測(cè)培養(yǎng)液中睪酮的濃度，比較NR4A1超表達(dá)組及陰性對(duì)照

6、組睪酮值的差異。 結(jié)果：(1)用RT-PCR方法，從人卵巢組織中擴(kuò)增出1797 bp的cDNA，測(cè)序證實(shí)為人NR4A1基因。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)BJ-5183細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了NR4A1基因的重組腺病毒質(zhì)粒AdCMV-NR4A1及對(duì)照質(zhì)粒AdCMV。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞后經(jīng)過(guò)包裝、擴(kuò)增最終得到高滴度重組病毒，以GFP為標(biāo)志測(cè)定AdCMV-NR14A1病毒滴度為107U/ml，AdCMV病毒滴度為108 U/ml。(2

7、)成功建立小鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)的方法，小鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)4天，達(dá)90％～X上的成活率。借助小鼠卵泡體外培養(yǎng)模型，實(shí)現(xiàn)了NR4A1在卵泡膜細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)。與對(duì)照組相比，在NR4A1超表達(dá)組中NR4A1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均升高，兩組間差異顯著(p<0.05)。最后，用RIA檢測(cè)NR4A1在小鼠卵泡膜細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)后睪酮分泌的變化，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中睪酮濃度明顯降低，兩組間差異顯著(p<0.05)，該結(jié)果表明NR4A1在小

8、鼠卵泡膜細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)明顯抑制了卵泡膜細(xì)胞睪酮的分泌。 結(jié)論：(1)本文在成功克隆人NR4A1基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建NR4A1重組腺病毒載體。人NR4A1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建為進(jìn)一步研究NR4A1在PCOS發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。(2)建立起小鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)模型，該模型為進(jìn)一步研究與PCOS發(fā)病相關(guān)的差異基因、蛋白的功能及其作用機(jī)制提供了良好的平臺(tái)。(3)NR4A1基因在小鼠卵泡膜細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)后明顯地抑制了卵泡膜細(xì)