抗人乳腺癌基因工程抗體免疫毒素表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、2 0 0 3 屆 南 開 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 七 年 制 臨 床 醫(yī) 學(xué) 專 業(yè) 碩 士 畢 業(yè) 論 文抗人乳腺癌 基因 工程抗體免 疫毒素表達(dá)載體的 構(gòu)建研究生 陳勇導(dǎo)師 王德發(fā) 副教授摘 要目 的: 通過基因 工程重組技術(shù)， 利用已 合成的抗乳腺癌單鏈抗體基因 S c F v ， 及自 綠 膿 桿 菌 基因 組 擴(kuò) 增的 其 外 毒 素 基因P E 4 0 ， 采 用 重 疊 延 伸 基因 拼 接 法 ( g e n es p l

2、 i c i n g b y o v e r l a p e x t e n s i o n ) 使 二 者 連 接。 并 利 用 擴(kuò) 增 時 導(dǎo) 人的 兩 端 酶 切 位 點，采 取 酶 切 使 之 克 隆 入 表 達(dá) 載 體p E T 2 1 a ( + ) 。 構(gòu) 建 好 的 免 疫 毒 素 表 達(dá) 載 體為 以 后的高效表達(dá)、 純化及細(xì) 胞毒實 驗打下了 基礎(chǔ)。 可望為 乳腺癌 及其他腫瘤的臨 床治療提供一種新的 選擇。

3、方法: 1 , P C R 擴(kuò)增: 設(shè)計引 物 擴(kuò)增S c F v時在其5 ' 端加人E c o R I 酶切位點， 擴(kuò)增P E 4 0 時在其3 ’ 端也加人E c o R I 位點， 在自 綠膿桿菌基因組D N A中擴(kuò)增P E 4 0時 采 用了 改良 套式P C R 法; 2 、 基因 片 段的 連接: 擴(kuò)增S c F v 的3 ' 引物與擴(kuò)增P E 4 0的5 ’ 引 物二者 有一段序 列完全相同， 因 此

4、使用重 疊延伸基因 拼接法使二者連 接;3 , 融 合基因 導(dǎo)人載 體: 融 合基因與載 體p E T 2 1 a ( + ) 均以E c o R I 酶切， 形成 粘性末端，因 而可以 順利導(dǎo)人; 4 、 重組體的 篩選及序 列分析: 堿裂 解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶 切鑒定， 以 確定載 體中 有 無插人 序列及插 人的 方向。 5 、 序列分析: 正在進(jìn)行中。結(jié)果:1 、 成功 得 到 抗 乳 腺 癌免 疫 毒 素的 表 達(dá) 載 體p

5、 E T 2 1 a ( + ) c2 , 酶切結(jié)果 顯示S c F v - P E 4 0 融合基因 正向 接 人載 體p E T 2 1 a ( + ) ;3 、 本實驗中， 應(yīng)用改良 套式 P C R法擴(kuò)增 P E 4 0 ， 亦達(dá)到預(yù)期效果采用重疊延伸基因 拼接法連接， 獲得成功。結(jié)論:1 、 構(gòu) 建抗人乳 腺癌免 疫毒素表達(dá)系 統(tǒng)獲 得成功;2 、 在P C R擴(kuò)增原核基因P E 4 0 時，由 于引物與 模板G , C

6、含量較高， 加人變性劑D M S O 使P C R 成功的 可能 性大大 增加， 我們在實驗中 使用改良 套式P C R2 0 0 3 屆 南 開 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 七 年 制 臨 床 醫(yī) 學(xué) 專 業(yè) 碩 士 畢 業(yè) 論 文C o n s t r u c t i o n o f e x p r e s s i o n v e c t o r o f r e c o m b i n a n t i m m u n o t o

7、 x i n a g a i n s tb r e a s t c a n c e r wi t h S c F v a n d P E 4 0D e g r e e c a n d i d a t e : C h e n Y o n gD i r e c t o r : Wa n g D e - f aAb s t r a c tO b j e c t i v e s : T o c o n s t r u c

8、 t a r e c o m b i n a n t i m m u n o t o x i n w i t h S c F v ( s i n g l e - c h a i nF r a g m e n t v a r i a b l e ) a n d P E 4 0 ( P s e u d o m o n a s e x o t o x i n A ) b y g e n e e n g i n e

9、 e r i n g . A n di n d u c e t h e f u s i o n - p r o t e i n o n t o e x p r e s s i o n v e c t o r p E T 2 1 a ( + ) . G e n e s p l i c i n g b y o v e r l a pe x t e n s i o n w a s u s e d i n c o

10、 m b i n i n g t h e S c F v a n d P E 4 0 . R e s t r i c t i o n e n z y m e s i t e s w e r ea d d e d t o b o t h 5 ' a n d 3 ' e n d s o f t h e f u s i o n g e n e b y P C R p r i m e r

11、 s . W i t h t h e d i g e s t i o n o fr e s t r i c t i o n e n z y m e s , t h e f u s i o n f r a g m e n t c o u l d b e i n d u c e d o n t o e x p r e s s i o n v e c t o rp E T 2 1 a ( + ) , w h i

12、c h w a s t h e n t r a n s f o r m e d i n t o E . c o l i c e l l l i n e J M1 0 9 a n d s e n t t os e q u e n c e .M e t h o d s :1 . C o m m o n P C R : S c F v w a s a m p l i f i e d w i t h d e

13、s i g n e d p r i m e r s . T h e u p p e r p r i m e r a d d sa n E c o R I r e s t r i c t i o n s i t e i n 5 ' , a n d t h e l o w e r o n e i s t o t a l l y c o m p l e m e n t e d w i t h t

14、 h eu p p e r p r i m e r o f P E 4 0 . A n d t h e l o w e r p r i m e r o f P E 4 0 h a s t h e r e s t r i c t i o n s i t e E c o R It o o .2 . G e n e s p l i c i n g b y o v e r l a p e x t e n

15、s i o n : T h i s m e t h o d c o u l d c o m b i n e t w o o r m o r e g e n ef r a g m e n t s w h i l e t h e c o m b i n i n g e n d s w e r e l a c k o f r e s t r i c t i o n s i t e s w i t h o u

16、 t i n d u c i n ga n y i r r e l e v a n t b a s e s t o t h e j o i n t o f t h e g e n e s .3 . I n d u c e t h e f u s i o n g e n e o n t o v e c t o r s : B o t h t h e f u s i o n g e n e a n d

17、 v e c t o r s w e r ed i g e s t e d b y r e s t r i c t i o n e n z y m e s p r e d e t e r m i n e d . S o t h a t t h e c o h e s i v e e n d s c o u l d l i n kt h e i r c o m l e m e n t a r y e n d

18、s e a s i l y a n d p r o p e r l y .4 . S c r e e n i n g a n d s e q u e n c i n g : A l k a l i n e l y s i s w a s u s e d t o e x t r a c t t h e v e c t o r p l a s m i d s ot h a t t o d i f f e