Streptomyces lividans中DndA蛋白的表達(dá)純化及表征.pdf

1、DNA是遺傳物質(zhì)的載體，DNA修飾一般發(fā)生在組成DNA的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶堿基上。而DNA的磷硫?；揎梾s是發(fā)生在DNA骨架磷原子和氧原子間的修飾，因而研究DNA的磷硫?；揎椌哂兄卮笠饬x。研究發(fā)現(xiàn)DNA骨架磷硫?；揎椗c五個(gè)基因組成的dnd基因簇(dndA-E)相關(guān)。其中 dndA基因編碼的DndA蛋白，是一類半胱氨酸脫硫酶。2012年鄧子新課題組解析了DndA（C/S）的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，分析發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的其他半胱氨酸脫硫酶

2、不同的是，DndA(C/S)中活性位點(diǎn)327位的半胱氨酸位于β折疊上，而傳統(tǒng)的半胱氨酸脫硫酶活性位點(diǎn)位于loop上，那么這種結(jié)構(gòu)差異是由于活性位點(diǎn)突變引起的？還是說DndA具有一種全新的脫硫機(jī)制？
　　為了研究 DndA(WT)的結(jié)構(gòu)，本文成功構(gòu)建了 dndA(WT)及活性位點(diǎn)突變型dndA(C327/S)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 BL21(DE3)，實(shí)驗(yàn)得到了 DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的上清可溶表達(dá)；將DndA

3、(WT)及DndA(C327/S)蛋白通過鎳柱、陰離子交換柱柱、凝膠過濾柱等的純化最終得到了純度高達(dá)95％的蛋白；CD譜圖及分析型75表征顯示DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的結(jié)構(gòu)整體相差不大。
　　為了證實(shí)DndA(WT)及DndA(C327/S)蛋白的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)差異，及研究DndA的脫硫機(jī)制，本文構(gòu)建了一系列用于DndA部分標(biāo)記PTS策略體內(nèi)表達(dá)所需的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后表達(dá)并進(jìn)行初步純化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明DndA在部分標(biāo)記P

4、TS策略體內(nèi)表達(dá)后未見明顯連接成功的目的蛋白；構(gòu)建DndA部分標(biāo)記PTS策略體外表達(dá)所需的碳端加His標(biāo)簽的dndA268-380-pSKBAD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ER2566表達(dá)后上清80%可溶，且對(duì)鎳柱親和能力較好，可以進(jìn)行后續(xù)的大量表達(dá)和純化以及標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，氮端質(zhì)粒dndA1-260-pSKDUET01在低濃度咪唑中即被洗脫，扔需后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化表達(dá)條件；在DndA部分標(biāo)記PTS策略沒有達(dá)到理想效果的情況下，實(shí)驗(yàn)對(duì)PTS策略中氮端所需質(zhì)