人Hexastatin基因的優(yōu)化、蛋白的表達(dá)純化及初步應(yīng)用.pdf

1、新血管生成是各種生理和病理過程發(fā)生的基礎(chǔ)。在胚胎形成和胎盤發(fā)育等正常生理過程中，新血管的生成是至關(guān)重要的；然而對于一些疾病的產(chǎn)生，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，同樣離不開新血管生成的作用。1971年Folkman提出了“腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成”的觀點，抑制腫瘤新生血管的形成，將會阻斷腫瘤細(xì)胞賴以生存的氧氣及營養(yǎng)供給，繼而造成腫瘤細(xì)胞的凋亡。此學(xué)說的提出為腫瘤的生物治療提供了新的策略。由于內(nèi)源性血管生成抑制因子顯示出抑制瘤

2、床內(nèi)皮細(xì)胞增殖的高度選擇性，因此被認(rèn)為是抗血管生成治療中最有潛力的藥物蛋白質(zhì)，尋找內(nèi)源性的血管生成抑制因子成為近年來研究的熱點。
　　 Hexastatin是一種新型的腫瘤血管生成抑制劑，它來源于Ⅳ型膠原蛋白α6鏈的非膠原區(qū)NCI，由229個氨基酸組成，分子量是25kD。近年來有研究證實Hexastatin具有抑制腫瘤新生血管生成和抗腫瘤的活性的作用。實驗研究表明，編碼α6鏈的COL4A6基因的異常表達(dá)與腫瘤的形成有直接關(guān)系；同

3、時還有研究發(fā)現(xiàn)Hexastatin在癌組織中含量的下調(diào)可以作為腫瘤浸潤的重要指標(biāo)，這些都起到預(yù)警的作用。
　　 本研究優(yōu)化并合成人Hexastatin基因，然后與pET28a表達(dá)載體連接，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的條件。在超聲破碎細(xì)菌和包涵體后，利用Ni-NTA層析柱純化蛋白，用SDS-PAGE和Western blot分析，并進(jìn)行腫瘤細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞的MTT活性實驗。實驗結(jié)果：成功構(gòu)建了pET28a-seq702表

4、達(dá)質(zhì)粒，并在BL21菌體中獲得高效可溶性表達(dá)，表達(dá)的可溶性Hexastatin蛋白占總蛋白量的45.1％，純化后的人Hexastatin蛋白的純度可達(dá)90%，濃度為160.24μg/ml;Western blot證實表達(dá)蛋白為目的蛋白；人Hexastatin蛋白對腫瘤細(xì)胞C6、MCF-7以及HMEC細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，抑制率分別高達(dá)72.9%±3.6、48.8%±2.9、52.7%±2.5，對照組相比均有顯著性差異，P＜0.05