丙型肝炎病毒F蛋白基因的克隆表達(dá)及初步應(yīng)用研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。據(jù)WHO估計(jì)，目前全世界約有1.8億HCV感染者，且呈增長趨勢。HCV是單股正鏈RNA病毒，HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高達(dá)75％～85％，可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，對人類的健康和生命構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。 丙型肝炎病毒屬黃病毒屬，全長約9.6kb，為一單股正鏈RNA，分為5’非翻譯區(qū)(UTR)、一個(gè)開放讀碼框(ORF)和3’非翻譯區(qū)，

2、編碼一個(gè)由3000多個(gè)氨基酸組成的復(fù)合蛋白前體，在宿主信號肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解產(chǎn)生至少10種基因產(chǎn)物：四種結(jié)構(gòu)蛋白(core，E1，E2，p7)和六種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。 而在HCV編碼的十幾種蛋白中，核心蛋白(core)是HCV多聚蛋白前體經(jīng)細(xì)胞信號肽酶剪切而產(chǎn)生的非糖基化蛋白，由191個(gè)氨基酸組成。該蛋白的氨基酸序列十分保守，具有調(diào)控多種細(xì)胞基因，影響細(xì)胞生長、增生及

3、凋亡的能力。 近年來外國學(xué)者在感染HCV的患者血清中發(fā)現(xiàn)了HCV-F蛋白，是由HCV核心基因編碼的另一個(gè)產(chǎn)物，它是由核心基因密碼子核苷酸移位后產(chǎn)生的。其在HCV不同基因型的高度保守性和在患者體內(nèi)抗體的存在，顯示F蛋白在HCV生命周期中起重要作用。 為了研究此種蛋白抗體在我國丙肝人群是否同樣存在及其分布情況，探討F抗體與HCV感染之間的關(guān)系。本文進(jìn)行了如下研究： 第一部分：丙型肝炎病毒F蛋白重組基因片段的克隆及其在

4、細(xì)菌中的表達(dá) 根據(jù)GENBANK提供的HCV1b序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增F蛋白基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，與用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，電泳回收后與用上述雙酶切割并電泳回收的pGEX-4T-2質(zhì)粒連接，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定可擴(kuò)增出與目的片段大小一致的DNA片段。同時(shí)提取重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定與比對分析，結(jié)果證實(shí)DNA插入序列正確。對構(gòu)建的重組工程菌用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAG

5、E電泳分析顯示HCV-F/GST(Glutathione S-transferase)特異性表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為43KD，表達(dá)量占菌體蛋白的15％左右。 本研究成功構(gòu)建了表達(dá)丙型肝炎F蛋白重組基因片段的工程菌，為獲得抗原性強(qiáng)、特異性好的F蛋白抗原奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：丙型肝炎病毒重組F表達(dá)蛋白的純化與初步鑒定 將HCV-F/GST重組工程菌大量培養(yǎng)后加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收菌并超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電

6、泳檢測，證實(shí)表達(dá)蛋白為可溶性蛋白。將超聲裂解上清置入Glutathione Sepharose 4B親和層析柱中，用洗脫液(還原型谷胱甘肽)洗脫。收集洗脫下來的蛋白溶液，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，并用紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度，于-30℃保存?zhèn)溆谩?同時(shí)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pGEX-4T-2入大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)GST蛋白，并進(jìn)行Glutathione Seplaarose 4B親和層析柱純化。 將純化獲得的HCV-F/GST融合表

7、達(dá)蛋白作抗原，稀釋后包被酶聯(lián)反應(yīng)板， ELISA間接法檢測已知的4份抗HCV陽性血清、4份正常人血清。結(jié)果顯示此表達(dá)蛋白能與3份抗HCV陽性血清反應(yīng)，而與1份抗HCV陽性血清和正常人血清不發(fā)生反應(yīng)。同時(shí)Western blot分析也證實(shí)此蛋白抗原能與陽性血清抗體發(fā)生特異性結(jié)合。以上結(jié)果初步說明該融合表達(dá)蛋白制備、純化較容易，并與丙肝病人血清出現(xiàn)特異性反應(yīng)。 本研究建立了表達(dá)蛋白的純化方法，并純化獲得了具有良好抗原性的HCV-F/

8、GST蛋白抗原。 第三部分：用HCV-F/GST蛋白做為抗原檢測丙肝病人血清抗體 將純化后的重組表達(dá)蛋白HCV-F/GST作為抗原包被酶聯(lián)反應(yīng)板，以待測血清標(biāo)本為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體為二抗，以GST蛋白孔作為本底對照，ELISA間接法分別檢測120份抗HCV陽性血清、10份正常人血清。結(jié)果重組蛋白與82份的抗HCV陽性血清均可發(fā)生特異性反應(yīng)(抗體陽性率68％)，而與10份正常人血清不起反應(yīng)。病例組與對

9、照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。發(fā)現(xiàn)50歲以上年齡組抗HCV-F抗體的陽性率高于20～50歲年齡組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)；中重度和肝硬化患者陽性率最高(p<0.05)；抗HCV-F抗體在男性和女性患者中的檢出無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；且與患者血清中HCVRNA的檢出無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.099)，而在HCV RNA各型別之間的檢出亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.926)。以上結(jié)果表明該融合表達(dá)蛋白具有較好的抗原性和特異性。 本研究建立了以

10、ELISA間接法為基礎(chǔ)的HCV-F/GST抗體檢測方法，并對檢測試劑、反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。 第四部分：HCV-F/GST多克隆抗體的制備 將純化后的重組表達(dá)蛋白HCV-F/GST作為抗原免疫BALB/c小鼠，取鼠尾血用間接ELISA法檢測抗HCV-F抗體效價(jià)≥1:10 000。加強(qiáng)免疫后摘眼球取血，分離血清。Western blot分析證實(shí)此免疫后血清可與HCV-F/GST蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，正常小鼠血清不與此蛋白發(fā)生反