丙型肝炎病毒核心蛋白的純化及結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、HCV是引起輸血型非甲非乙型肝炎的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計世界約有1.7億人感染HCV[1]，85％的感染者進入慢性感染階段，其中20％的感染者在隨后的肝疾病中進一步惡化導(dǎo)致肝硬化及肝癌。HCV核心蛋白為RNA結(jié)合蛋白，富含大量堿性氨基酸，是核衣殼的重要組成部分，參與病毒的裝配[2]以及細胞因子間相互作用，因此核心蛋白的研究對于HCV的深入了解及防治有著極其重要的作用。
　　 本實驗首先獲得HCV核心蛋白基因序列(HCV-core)

2、，它由573個堿基組成一個開放閱讀框ORF，編碼191個氨基酸，預(yù)測分子量為21 kD，等電點為11.56，富含堿性氨基酸。生物信息學(xué)分析核心蛋白并設(shè)計引物，PCR擴增core基因，將其克隆到原核表達載體pET-28a上構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-core，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE及Western blotting鑒定成功。大量培養(yǎng)重組菌，裂解后通過鎳柱親和層析及陽離子交換層析純化，經(jīng)SDS-PAGE及W

3、estern blotting鑒定存在陽性結(jié)果。
　　 PCR擴增core基因，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-28a-polh-core，轉(zhuǎn)化入E.coliBL21并誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE及Western blotting鑒定成功。大量誘導(dǎo)重組菌，高壓破碎后，利用多角體蛋白(Polh)堿性條件溶解的特性，通過調(diào)節(jié)緩沖液pH及差速離心的方法純化融合蛋白。純化的融合蛋白Polh-Core經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，用于制備多克隆抗體為融合蛋白的后

4、續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。融合蛋白Polh-Core經(jīng)凝血酶酶切除去Polh，獲得核心蛋白Core。同時初步篩選融合蛋白Polh-Core結(jié)晶條件，旨在利用融合蛋白及已知的Polh蛋白結(jié)構(gòu)推測出核心蛋白的三級結(jié)構(gòu)，為HCV的防治奠定基礎(chǔ)。
　　 同時利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達純化核心蛋白，首先將core基因構(gòu)建到轉(zhuǎn)移載體pFastBacl中成功構(gòu)建pFastBacl-core，將重組pFastBacl-core轉(zhuǎn)化入帶有桿粒的BmDH1

5、0Bac中，通過Kan、Gen及Tet的三抗平板和藍白斑篩選，挑選重組的白斑提取重組Bacmid。PCR鑒定后，轉(zhuǎn)染家蠶細胞BmN獲得重組桿狀病毒vBmCore。重組病毒感染BmN細胞發(fā)病后經(jīng)SDS-PAGE及Westernblotting鑒定核心蛋白表達成功。利用免疫親和層析純化核心蛋白。另外，將重組病毒接種到五齡蠶中取淋巴血經(jīng)鑒定核心蛋白在蠶體中成功獲得表達。
　　 此外，實驗中采用多種方法純化核心蛋白，進行比較后發(fā)現(xiàn)在核心