DHBV衣殼蛋白表達(dá)純化、初步應(yīng)用及其編碼基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)時相的研究.pdf

1、1.DHBV PreC/C基因序列分析、克隆表達(dá)、蛋白純化及多抗制備
　　為了建立DHBV快捷準(zhǔn)確的檢測方法及深入探究鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白的功能，對DHBV CHv株P(guān)reC/C基因及其編碼蛋白的分子特性進行了分析。PCR方法擴增編碼衣殼蛋白的PreC/C基因，經(jīng)測序鑒定后構(gòu)建PreC/C基因的原核表達(dá)載體pET-32a(+)/PreC/C。利用大腸桿菌宿主表達(dá)菌Rosetta(DE3)對衣殼蛋白進行誘導(dǎo)表達(dá)，同時對誘導(dǎo)溫度、誘

2、導(dǎo)時間、IPTG濃度進行了優(yōu)化。利用重組衣殼蛋白的組氨酸標(biāo)簽，采用Ni離子親和層析柱對衣殼蛋白進行純化。通過純化的衣殼蛋白免疫大白兔制備兔抗DHBV衣殼蛋白多克隆抗體。結(jié)果表明，PreC/C基因長789 bp，編碼262個氨基酸的衣殼蛋白。構(gòu)建有PreC/C基因原核表達(dá)載體pET-32a(+)/PreC/C在表達(dá)菌Rosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)時，DHBV衣殼蛋白在誘導(dǎo)溫度37℃、IPTG濃度0.8mM、誘導(dǎo)時間6h的條件下其表達(dá)量

3、達(dá)到最高，占菌體總蛋白量的80％以上。利用Ni離子親和層析柱對帶有組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白進行純化后得到條帶單一、濃度達(dá)2mg/mL的重組衣殼蛋白。通過純化的衣殼蛋白免疫動物所得到的血清在瓊擴試驗中效價達(dá)到1∶32。
　　2.鴨乙型肝炎病毒衣殼蛋白間接ELISA方法的建立
　　為了建立穩(wěn)定可靠的DHBV血清學(xué)診斷方法，本研究利用重組表達(dá)的DHBV衣殼蛋白建立間接ELISA診斷方法。利用棋盤滴定法對抗原最佳包被量進行了優(yōu)化，隨后對

4、抗原的包被時間、包被溫度進行了優(yōu)化，同時對間接ELISA方法中的封閉時間、二抗工作濃度等條件進行了優(yōu)化。利用建立的ELISA方法對27份DHBV陰性血清進行檢測，確定了判定樣品為陰性或陽性的臨界值，并通過該臨界值對建立的ELISA方法敏感性、特異性、重復(fù)性及可靠性等進行了評估。結(jié)果表明，基于重組表達(dá)衣殼蛋白間接ELISA方法的最佳反應(yīng)條件為:抗原37℃包被2h后4℃過夜，6.7μg/孔;1％BSA37℃封閉2h;二抗工作濃度為1∶100

5、0;待檢血清稀釋至1∶160。根據(jù)確定的臨界值0.392，DHBV陽性血清能被檢測為陽性的最大稀釋倍數(shù)為1∶12800;重復(fù)性試驗表明組內(nèi)、組間試驗的變異系數(shù)均小于10％;該ELISA方法檢測常見鴨源病原抗血清時均無陽性結(jié)果;對75份臨床樣品進行檢測時，與傳統(tǒng)的檢測方法PCR相比達(dá)到95.45％的符合率。說明該DHBV衣殼蛋白間接ELISA檢測方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強的特點。此外，本方法運用羊抗鴨IgG抗體替代了兔抗鴨與羊抗

6、兔抗體的聯(lián)用，是該方法更為簡便快捷、節(jié)約成本。
　　3.PreC/C基因轉(zhuǎn)錄時相及表達(dá)時相的研究
　　DHBV基因組在復(fù)制的過程中會先轉(zhuǎn)錄形成一條長鏈RNA（preRNA），然后反轉(zhuǎn)錄形成DNA達(dá)到病毒基因組復(fù)制的目的。該長鏈RNA除了扮演DHBV基因組復(fù)制中間體的角色外，還能作為DHBV DNA多聚酶P蛋白的mRNA翻譯為P蛋白，或充當(dāng)DHBV PreC/C基因的mRNA，翻譯為DHBV的衣殼蛋白。本研究通過建立的DHBV

7、感染鴨原代細(xì)胞模型，采用實時熒光定量PCR技術(shù)及相對定量分析方法，對preRNA在病毒感染細(xì)胞后的不同時間點進行定量分析。在相同時間點，運用間接免疫熒光及免疫印跡技術(shù)對DHBV衣殼蛋白的表達(dá)情況進行檢測。結(jié)果表明，preRNA在病毒感染后的12h開始出現(xiàn)，20h達(dá)到最大峰值;而衣殼蛋白在病毒感染后的12h及20h并未被檢測到，直到24h才能被檢測到。說明preRNA在DHBV在體外感染細(xì)胞的早期并不用于衣殼蛋白的翻譯，該結(jié)論為DHBV病