N，O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2基因的克隆及在枯草桿菌和畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、本文根據(jù)GenBank中已登記N,O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到了R2酶成熟肽編碼基因。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-R2，經(jīng)過雙酶切及PCR驗(yàn)證，證明克隆到pMD18-T載體上的外源基因即胞壁質(zhì)酶R2基因。核苷酸序列測定表明，R2酶基因由655個(gè)堿基組成，與已報(bào)道的N,0-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2基因序列一致。對(duì)胞壁質(zhì)酶R2基因進(jìn)行了限制酶切圖譜分析。 將pMD18-

2、T-R2上的N,O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2基因經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ雙酶切后，與經(jīng)過相同酶切處理的pMA5載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-R2。然后將重組質(zhì)粒pMA5-R2用SstI酶切去除與表達(dá)無關(guān)的片段，自連后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌BCL1050，在卡那霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并將此重組質(zhì)粒命名為pMA5-R2-a。在篩選到的轉(zhuǎn)化子中N,0-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2基因得到了較高水平的表達(dá)，酶活達(dá)到138U/mL。對(duì)轉(zhuǎn)化子pMA5-

3、R2-a/BCL1050發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后酶活可達(dá)240U/mL。與以LB為培養(yǎng)基相比，酶活提高了1.75倍。對(duì)重組胞壁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與天然N,0-二乙酰胞壁質(zhì)酶基本一致。 通過EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，將N,0-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2基因按照質(zhì)粒閱讀框的轉(zhuǎn)譯方向插入到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K的MCS中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-R2。利用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化表型為His-的畢赤酵母宿主菌株SMD1168，利用