軟化芽孢桿菌α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在畢赤酵母和枯草桿菌中的表達(dá).pdf

1、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,簡(jiǎn)稱(chēng)CGT酶,它能夠通過(guò)轉(zhuǎn)葡糖苷作用催化低聚糖生成偶合糖,通過(guò)糖基化反應(yīng)對(duì)甜菊苷進(jìn)行改性,還可以通過(guò)環(huán)化反應(yīng)利用淀粉催化得到環(huán)糊精,由于上述物質(zhì)獨(dú)有的特性和特有的用途,使得它們?cè)谑称返阮I(lǐng)域的應(yīng)用逐漸推廣。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作中已對(duì)來(lái)源于軟化芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)JFB05-01的α-CGT酶在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行了廣泛的研究。本研究從食品安全生產(chǎn)為出發(fā)點(diǎn),嘗試從畢赤酵母

2、和枯草桿菌這兩種工業(yè)上廣泛使用的宿主菌入手,研究軟化芽孢桿菌α-CGT酶在重組畢赤酵母(Pichia pastoris)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)中的表達(dá),并通過(guò)一系列發(fā)酵條件優(yōu)化,旨在不斷提高重組酶的表達(dá)量。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)將來(lái)源于軟化芽孢桿菌的α-CGT酶基因插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K的信號(hào)肽下游,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPCGT,將其轉(zhuǎn)化P.pastoris KM71,獲得了產(chǎn)α-CGT

3、酶的基因工程菌P.pastoris KM71/pPCGT,但是經(jīng)搖瓶培養(yǎng)96 h后,胞外酶活僅0.2 U/mL,SDS-PAGE未檢測(cè)到目的蛋白條帶。從密碼子偏愛(ài)性和糖基化角度對(duì)CGT酶在畢赤酵母中表達(dá)量低的原因進(jìn)行了深入的分析,發(fā)現(xiàn)畢赤酵母極低頻率使用密碼子在cgt基因中所占比例為8％,同時(shí)該酶中存在9個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),密碼子不偏愛(ài)以及潛在的糖基化可能會(huì)影響CGT酶在畢赤酵母中的表達(dá)。
　　 (2)將α-CGT酶基因插入枯草

4、桿菌組成型載體pMA5的信號(hào)肽下游,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMCGT,轉(zhuǎn)化B.subtilis WB600進(jìn)行表達(dá),搖瓶培養(yǎng)36 h后重組B.subtilisWB600/pMCGT胞外酶活力為1.9 U/mL,而陰性對(duì)照WB600/pMA5檢測(cè)不到酶活,且SDS-PAGE表明細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有包涵體。對(duì)重組菌株進(jìn)行初步搖瓶?jī)?yōu)化,確定較優(yōu)條件為:初始培養(yǎng)基為T(mén)B,溫度37℃,初始pH為7,最佳接種量4％,在該條件下,胞外酶活達(dá)到4.3 U/mL。
　

5、　 (3)將α-CGT酶基因連接枯草桿菌誘導(dǎo)型載體pGJ103后轉(zhuǎn)化B.subtilis WB600,獲得了胞外分泌表達(dá)P.maceransα-CGT酶的重組B.subtilis WB600/pGCGT菌株,在1％的麥芽糖初始發(fā)酵培養(yǎng)基上搖瓶培養(yǎng),48 h后重組枯草桿菌產(chǎn)酶活性為5.1 U/mL。與重組B.subtilis WB600/pMCGT相比,胞外酶活較高,并且目的蛋白也都分泌到了胞外?？疾炝嗽撜T導(dǎo)型菌株的種子生長(zhǎng)情況,對(duì)數(shù)生

6、長(zhǎng)期為4至12小時(shí),8小時(shí)為最佳種齡,另外考察了菌株穩(wěn)定性,傳代5代后質(zhì)粒保持率在92％以上。
　　 (4)對(duì)重組B.subtilis WB600/pGCGT菌株進(jìn)行了搖瓶條件優(yōu)化。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到誘導(dǎo)劑麥芽糖的最佳濃度為15 g/L,最適碳、氮源分別為玉米淀粉和酵母粉,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面方法考察了三者配比的最佳濃度,最終確定了發(fā)酵培養(yǎng)基組分為麥芽糖15.5 g/L,玉米淀粉13 g/L,酵母粉20

7、 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸鈉2 g/L,K2HPO412.4 g/L,KH2PO42.3 g/L。在此優(yōu)化條件下,搖瓶α-CGT酶的酶活為17.6 U/mL。
　　 (5)對(duì)重組B.subtilis/pGCGT在5 L罐中的發(fā)酵工藝進(jìn)行初步研究。通過(guò)分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)確定細(xì)胞生長(zhǎng)和α-CGT酶合成所需溶氧為20％。在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上,初步嘗試了分批補(bǔ)加蔗糖對(duì)重組B.subitilis產(chǎn)α-CGT酶的影響,補(bǔ)加25 g/L蔗糖,誘