羅漢果葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、羅漢果(Siraitia grosvenorii)是僅分布于廣西北部山區(qū)的中國(guó)特有的藥用和甜料植物，其有效成分甜苷V(Mogrosides V)是世界上最強(qiáng)的非糖甜味物質(zhì)之一，亦具有很好的藥理藥效，應(yīng)用前景十分廣闊。但甜苷V含量低、生產(chǎn)成本高的問(wèn)題嚴(yán)重制約著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)調(diào)查，甜苷V的含量每增加0.1％，其提取成本可降低10％。因此，提高甜苷V含量的研究已成為熱門(mén)的研究方向。采用傳統(tǒng)的改進(jìn)栽培措施或雜交育種等法來(lái)提高甜苷V含量難度大、周

2、期長(zhǎng)，且提高有限。從分子水平闡明甜苷V生物合成途徑，找到控制甜苷V合成的關(guān)鍵酶基因，利用基因工程技術(shù)對(duì)羅漢果進(jìn)行分子育種，是提高甜苷V含量快速而有效的新途徑。葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucoyltranferae，UDPG)作為甜苷V生物合成中最后一步關(guān)鍵酶而成為研究重點(diǎn)。
　　 通過(guò)羅漢果轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜及含量的關(guān)聯(lián)分析，獲得兩條與甜苷V生物合成相關(guān)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDPG)的unigene片段，以羅漢果授粉后70 d的果實(shí)

3、RNA為模板，利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆UDPG全長(zhǎng)基因，將克隆得到的SgUDPG1基因和SgUDPG2基因連接到原核表達(dá)載體EASyTM-E1上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白純化，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物以及Western-blotting和質(zhì)譜鑒定蛋白產(chǎn)物。
　　 結(jié)果表明，獲得了1條SgUDPG1，全長(zhǎng)為1959 bp，開(kāi)放閱讀框ORF為1365 bp，編碼一條454

4、aa的肽鏈，理論分子量為51.2 kD，等電點(diǎn)為5.39，具有植物中次生代謝產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶特有的保守結(jié)構(gòu)域PSPG-box motif。SgUDPG1在授粉后50 d和70 d的果實(shí)中表達(dá)逐漸升高，是對(duì)照授粉后3d的5.16倍和13.12倍，與果實(shí)中甜苷V含量呈相同趨勢(shì)。經(jīng)探究SgUDPG1原核表達(dá)最優(yōu)條件的實(shí)驗(yàn)，獲得SgUDPG1表達(dá)的最佳IPTG的濃度為0.1mmol·L-1，表達(dá)的最佳時(shí)間為3h，表達(dá)的最佳溫度為17℃，此基因的O

5、RF可以在大腸桿菌中表達(dá)，并且可以純化出比理論分子量大5.3 kD的融合蛋白，通過(guò)Western-blotting和質(zhì)譜鑒定，確定該蛋白屬于羅漢果葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
　　 同時(shí)獲得1條SgUDPG2，全長(zhǎng)為1722 bp，開(kāi)放閱讀框ORF為1440 bp，編碼一條479aa的肽鏈，理論分子量為52.3 kD，等電點(diǎn)為5.10，也具有次生代謝產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶特有的保守結(jié)構(gòu)域PSPG-box motif。 SgUDPG2在授粉后50 d

6、和70 d的果實(shí)中表達(dá)逐漸升高，是對(duì)照授粉后3d的1.52倍和10.31倍。SgUDPG2原核表達(dá)的最佳IPTG濃度為0.1mmol·L-1，表達(dá)的最佳時(shí)間為12h，表達(dá)的最佳溫度為17℃，此基因的ORF可以在大腸桿菌中表達(dá)，并且可以純化出比理論分子量大5.6 kD的融合蛋白，通過(guò)Western-blotting鑒定，初步確定為羅漢果葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶。
　　 本論文對(duì)2個(gè)與羅漢果甜苷V生物合成密切相關(guān)的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了RA