小麥UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Ta-UGT3的表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化小麥研究.pdf

1、小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是一種由鐮刀菌引起的世界性的真菌病害。FHB不僅降低作物產(chǎn)量，而且在侵染小麥穗組織的過(guò)程中產(chǎn)生的禾谷鐮刀菌毒素嚴(yán)重影響籽粒品質(zhì)，危害人畜健康。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是最主要的一類毒素。DON還抑制真核生物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，被認(rèn)為是赤霉病的致病因子(Bai et al.，2001)。培育抗病品種是目前控制小麥中DON含量的最有效方法。

2、　　 望水白表現(xiàn)高抗赤霉病，籽粒中DON積累量也明顯低于其他小麥品種。本課題組應(yīng)用芯片雜交結(jié)合cDNA文庫(kù)篩選，在望水白中克隆了一個(gè)小麥二磷酸尿核甘葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Ta-UGT3)。Ta-UGT3定位于與望水白抗赤霉病或抗DON的QTL相同的染色體3BS上，RT-PCR結(jié)果顯示Ta-UGT3受DON誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)Ta-UGT3轉(zhuǎn)基因植株DON抗性驗(yàn)證結(jié)果顯示，該基因在擬南芥體內(nèi)的過(guò)量表達(dá)在一定程度上可以增強(qiáng)擬南芥幼苗對(duì)D

3、ON的耐受力，推測(cè)Ta-UGT3與抗赤霉病或抗DON密切相關(guān)。
　　 為進(jìn)一步研究該基因在小麥抗赤霉病中的功能，本研究構(gòu)建了在35S強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的Ta-UGT3基因的表達(dá)載體pBI-Ta-UGT3。對(duì)所構(gòu)建的融合表達(dá)載體pBI-Ta-UGT3的進(jìn)行PCR檢測(cè)和BamHⅠ、KpnⅠ雙酶切，結(jié)果顯示基因Ta-UGT3已經(jīng)成功構(gòu)建到融合表達(dá)載體中。利用基因槍法將pBI-Ta-UGT3和攜帶Bar基因的表達(dá)載體pAHC25共轉(zhuǎn)化高感赤

4、霉病的小麥品種Alondra’s，共獲得108再生T0代植株。T0代轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色檢測(cè)結(jié)果顯示：在108個(gè)T0代單株中，有33株的后代根尖被染成藍(lán)色。根據(jù)GUS染色結(jié)果，在T0代植株中選取12個(gè)株系種植于江浦赤霉病大棚中，利用35S啟動(dòng)子和Ta-UGT3基因拼接引物對(duì)T0植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株轉(zhuǎn)入了Ta-UGT3基因。對(duì)這4個(gè)T0代株系的T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，Ta-UGT3基因產(chǎn)生了分離，運(yùn)用χ2測(cè)驗(yàn)對(duì)

5、陽(yáng)性植株和陰性植株分離比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有T0-92衍生T1株系的陽(yáng)性植株與陰性植株分離比例符合3:1，其余三個(gè)株系比例接近1:1，進(jìn)一步證明了Ta-UGT3基因已整合進(jìn)受體基因組。對(duì)4個(gè)T0代衍生株系的T1代轉(zhuǎn)化植株利用單花滴注法進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，所得數(shù)據(jù)運(yùn)用SAS軟件中兩樣本均值的雙尾t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示：在鑒定的所有T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中，接種B4-1或者F0609類型赤霉菌后，與受體對(duì)照相比，四個(gè)株系T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株