基于LC-MS-MS絕對定量人肝細胞中藥物轉運體及其應用.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討藥物轉運蛋白絕對表達量與其生物功能相關性，可為新藥研發(fā)和臨床安全用藥研究提供新的方法。
　　研究方法：
　　選取藥物轉運體OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP作為研究對象。首先優(yōu)化藥物轉運體膜蛋白的樣品前處理過程，其中包括膜蛋白的提取、增溶劑的選擇和胰蛋白酶與蛋白的比率；然后人工合成能代表人肝細胞中OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP蛋白的特異性肽段標準

2、品，將相應的穩(wěn)定性同位素標記的肽段作為內標，優(yōu)化色譜條件和質譜條件，采用多監(jiān)測反應模式，建立同時測定OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP的分析方法，并進行方法學驗證，運用該方法測定23個凍存的人肝細胞藥物轉運體的表達水平。
　　通過三明治培養(yǎng)的人肝細胞對底物氘代?；悄懰徕c和瑞舒伐他汀的攝取實驗，測出不同批次的肝細胞對這兩個底物整體的轉運活性。再通過穩(wěn)定轉染人 OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NT

3、CP基因的HEK293細胞對底物氘代?；悄懰徕c和瑞舒伐他汀的攝取實驗，測定出相應的Km和Vmax值。最后將測定得到的轉運體表達水平與轉運體活性相結合，預測轉運體介導的對氘代?；悄懰徕c和瑞舒伐他汀的攝取清除，并研究轉運體表達和活性相關性。
　　通過丹紅注射液對細胞攝取瑞舒伐他汀的抑制實驗，研究丹紅注射液對藥物轉運體OATPs和NTCP的作用，并分析丹紅注射液與瑞舒伐他汀聯(lián)合使用時是否會產生藥物間相互作用。
　　研究結果：

4、>　　使用膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白時重復性好；月桂酸鈉作為轉運體膜蛋白的增溶劑，其增溶效果比脫氧膽酸鈉增溶效率更高，并且對特異性肽段的離子化無抑制作用；轉運體蛋白酶水解時胰蛋白酶與蛋白的最佳比例為1：5。建立同時測定人肝細胞中四種藥物轉運體OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP的LC-MS/MS分析方法，其定量下限、精密度和準確度均符合大分子的生物分析方法規(guī)定。OATP1B1、OATP1B3和OATP2B1均在0.2

5、-50nM范圍內線性良好，（r＞0.995）。測定出23個批次中國人肝細胞中的OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP蛋白表達平均值分別為4.74、1.39、3.02和3.69 fmol/μg，并發(fā)現(xiàn)不同個體之間蛋白表達有很大的差異。
　　在底物攝取實驗中，結合轉運體蛋白定量，發(fā)現(xiàn)這四種轉運體在對氘代牛黃膽酸鈉和瑞舒伐他汀的肝細胞轉運過程中，NTCP分別占整個攝取的89％和68%。又通過人肝細胞模型測定了這兩個底物

6、體外整體攝取活性，并比較了這兩個底物肝細胞主動攝取清除率預測值跟測定值間的差異，結果顯示線性回歸相關系數為0.74和0.66；在spearman相關性分析中，spearman秩相關系數rs分別為0.1319和0.3604，均呈正相關。
　　丹紅注射液對瑞舒伐他汀在OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP細胞中攝取都有一定的抑制作用，IC50分別為0.38mL/100mL,0.14 mL/100mL,0.72 mL/