AhR活化對(duì)結(jié)腸炎性損害的緩解作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD），包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種慢性腸道特發(fā)性疾病。大量研究表明遺傳、環(huán)境及免疫因素均與IBD相關(guān)。其中，免疫調(diào)節(jié)紊亂目前被認(rèn)為是IBD發(fā)病的主要病因，但其發(fā)病機(jī)制仍未研究透徹。腸粘膜屏障(Intestinal mucosal barrier，IMB)包括機(jī)械屏障、

2、免疫屏障、生物屏障及化學(xué)屏障，是腸上皮抵抗外源物質(zhì)的重要屏障。腸粘膜機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞（Intestinal epithelial cell，IEC）及細(xì)胞之間的緊密連接(Tight junction，TJ)構(gòu)成。其中，TJ起著重要的作用。研究表明，腸道炎癥與TJ之間有著密切的關(guān)系。IBD患者的腸道緊密連接嚴(yán)重破壞，腸道通透性明顯增加。另外，腸道緊密連接屏障的破壞會(huì)導(dǎo)致腸腔內(nèi)有毒分子的滲透，誘導(dǎo)粘膜免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)，引發(fā)腸道疾病甚至

3、全身系統(tǒng)性疾病如全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)及多器官功能衰竭(Mutiply organ failure，MOF)。因此，目前認(rèn)為有效的抑制炎癥及維持腸粘膜屏障功能是目前治療IBD的主要策略。
　　芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AhR），是一種廣泛表達(dá)于機(jī)體各種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。AhR通過與配體結(jié)合活化的方式入核，與Ah

4、R核轉(zhuǎn)錄子(AhR nucleartranslocator，ARNT)形成異源二聚體，特異性結(jié)合于AhR反應(yīng)原件，誘導(dǎo)包括細(xì)胞色素酶4501A1（Cytochrome P4501A1，CYP1A1）等一系列下游基因的表達(dá)。6-甲酰基吲哚并[3，2-B]咔(6-formylindolo(3，2-b) carbazole，F(xiàn)ICZ)是AhR的一種內(nèi)源性配體，研究表明，F(xiàn)ICZ可以通過活化AhR參與細(xì)胞生理功能的維持，包括調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡，

5、抑制免疫反應(yīng)等。
　　目前多項(xiàng)研究表明AhR活化可以抑制腸道炎癥，但是其具體機(jī)制仍不清楚。另一方面，我們實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明，AhR可以在腸梗阻模型中通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)和定位緩解腸粘膜屏障功能異常。
　　因此，本課題通過模擬IBD動(dòng)物模型及體外細(xì)胞模型，采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblotting，WB)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitation PCR，Real-timeQ-P

6、CR)、免疫組化（Immunohistochemical，IHC）、免疫熒光(Immunofluorescence，IF)、跨膜電阻測(cè)量等技術(shù)，研究AhR活化減輕IBD腸道炎癥及緩解腸粘膜屏障功能異常的具體機(jī)制。
　　方法：
　　1.建立小鼠DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，通過給予小鼠FICZ腹腔注射處理，用小鼠體重改變、結(jié)腸長(zhǎng)度、死亡率、結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變及炎癥因子表達(dá)來評(píng)估小鼠腸道炎癥的炎性損害情況。采用Western blotti

7、ng、Real-time Q-PCR、IHC等技術(shù)檢測(cè)CYP1A1、(tristetraprolin) TTP、ZO-1、claudin-1、occludin等的表達(dá)變化。使用Ussing Chamber檢測(cè)小鼠結(jié)腸跨上皮電阻。觀察AhR活化對(duì)結(jié)腸炎炎癥及腸粘膜屏障功能的影響。
　　2.建立腸上皮細(xì)胞系LPS干預(yù)模型，通過給予FICZ處理、siRNA干擾AhR處理后，采用Western blotting、Real-time Q-P

8、CR、IF等技術(shù)檢測(cè)CYP1A1、TTP、MAPKAPK2、p-MAPKAPK2的表達(dá)，探討AhR活化緩解結(jié)腸炎炎癥的機(jī)制。
　　3.建立腸上皮細(xì)胞系TNF-α/IFN-γ干預(yù)模型，通過給予FICZ處理，用Westernblotting、Real-time Q-PCR、IF等技術(shù)檢測(cè)CYP1A1、ZO-1、claudin-1、occludin等的表達(dá)變化，并檢測(cè)細(xì)胞的跨上皮電阻(TER)，探討AhR活化維持腸粘膜屏障功能的具體機(jī)制

9、。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠DSS模型中，相比于Sham組，DSS處理組小鼠體重明顯降低，死亡率增加，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，腸粘膜正常形態(tài)學(xué)改變（表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞融合脫落等）。小鼠結(jié)腸跨上皮電阻下降，腸粘膜通透性增加，腸粘膜屏障功能受損。而給予小鼠AhR激動(dòng)劑FICZ后，同DSS組相比較，小鼠體重有所回升，死亡率降低，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加，而腸粘膜損傷也有所緩解。小鼠結(jié)腸跨上皮電阻增加，腸粘膜屏障功能有所恢復(fù)。
　

10、　2.小鼠DSS模型中，給予FICZ可以顯著上調(diào)CYP1A1的表達(dá)，活化AhR。并且可以上調(diào)RNA結(jié)合蛋白TTP的表達(dá)。
　　3.體外LPS干預(yù)模型中，F(xiàn)ICZ可以顯著上調(diào)TTP表達(dá)。siRNA干擾AhR后，TTP表達(dá)有所下降，并且給予FICZ不能上調(diào)TTP的表達(dá)。另一方面，F(xiàn)ICZ可以抑制MK2的磷酸化。siRNA干擾AhR后，F(xiàn)ICZ不再能抑制MK2的磷酸化。
　　4.小鼠DSS模型中，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎結(jié)腸上皮中緊密連

11、接蛋白如ZO-1、claudin-1、occludin的表達(dá)有下降。而給予FICZ處理后可以顯著上調(diào)ZO-1、claudin-1、occludin的表達(dá)。
　　5.體外TNF-α/IFN-γ干預(yù)模型中，相比于TNF-α/IFN-γ處理組，給予FICZ可以上調(diào)細(xì)胞的跨上皮電阻，并且可以緩解ZO-1的結(jié)構(gòu)破壞。另一方面，F(xiàn)ICZ可以增加MLC的磷酸化。
　　結(jié)論：
　　1.FICZ在體內(nèi)體外模型中均可以活化AhR。