金蕎麥對潰瘍性結(jié)腸炎的抗炎作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種，中醫(yī)學(xué)歸于“腹痛”、“泄瀉”、“便血”等范疇。其病因尚不十分明確，現(xiàn)代研究表明核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor，NF-κB)信號通路、炎癥小體信號通路（Inflammasome）NLRP3與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并導(dǎo)致一系列炎癥因子的釋放。目前，臨床上

2、缺乏對UC的有效且副作用少的治療藥物，中草藥因其安全、低毒、有效等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。
　　金蕎麥（Fagopyrumcymosum，F(xiàn)AG），是一種蓼科的草本植物根莖和蕎麥物種，傳統(tǒng)被廣泛用于治療肺炎，菌痢等，臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)AG對腹瀉性腸易激綜合征治療亦有效，其機(jī)制可能與其抗炎、腸黏膜保護(hù)作用相關(guān)，但目前未見金蕎麥對潰瘍性結(jié)腸炎的作用及機(jī)制的深入研究報道。本課題擬從以下四部分研究:一:金蕎麥提取物中主要活性成分在潰瘍性結(jié)腸

3、炎小鼠胃腸道的分布研究;二:金蕎麥提取物對TNBS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的藥效學(xué)研究;三:金蕎麥提取物對DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠藥效學(xué)研究;四:從NF-κB及NLRP3信號通路角度研究金蕎麥提取物的抗炎機(jī)制。期望通過上述研究，進(jìn)一步確證金蕎麥提取物對潰瘍性結(jié)腸的治療作用，并初步探討其機(jī)制。
　　方法：
　　1、首先建立采用HPLC法同時測定了金蕎麥提取物中原兒茶酸，兒茶素，表兒茶素，原花青素B1，原花青素B2的分析方法。

4、采用外標(biāo)法，求得樣品中原兒茶酸的含量為6.98mg/g，兒茶素的含量為2.64mg/g，表兒茶素的含量為17.84mg/g，原花青素B1的含量為4.07mg/g，原花青素B2的含量為8.43mg/g。在此基礎(chǔ)上，我們建立了同時測定小鼠生物樣品中兒茶素，表兒茶素，原花青素B1，原花青素B2的LC-MS/MS分析方法，并進(jìn)行專屬性、線性、回收率、準(zhǔn)確度、精密度的考察。采用DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，正常小鼠及潰瘍性結(jié)腸炎小鼠分別給予金蕎

5、麥提取物(2.28g/kg)，于不同時間點(diǎn)取血漿、肝臟、空腸、結(jié)腸。結(jié)果表明兒茶素、原花青素B1和原花青素B2在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中的系統(tǒng)暴露程度均有所增加。組織分布結(jié)果顯示金蕎麥中主要活性成分兒茶素、表兒茶素、原花青素B1和原花青素B2在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的肝臟組織、空腸、結(jié)腸組織中的濃度較正常組高。提示在病理狀態(tài)下，這些成分的高濃度分布，可以有效的保證其效應(yīng)的發(fā)揮。
　　2、采用TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，使用不同劑量的Fag提取物(

6、0.57，1.14，2.28g/kg)和柳氮磺吡啶(SASP，200mg/kg)，觀察體重變化，結(jié)腸長度，對結(jié)腸組織H&E染色并病理學(xué)評分，測定炎癥細(xì)胞浸潤情況（F4/80標(biāo)記陽性），測定結(jié)腸髓過氧化物酶(MPO)活性，血漿中的LPS和促炎細(xì)胞因子水平，以及促炎細(xì)胞因子mRNA在結(jié)腸中表達(dá)情況。結(jié)果表明金養(yǎng)麥提取物可顯著改善由TNBS誘導(dǎo)的小鼠體重減輕、結(jié)腸縮短，降低結(jié)腸病理評分及MPO活性。同時金蕎麥提取物可顯著抑制TNBS引起的小鼠

7、結(jié)腸組織中IL-6，IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)，降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血漿中的LPS，IL-6，IL-1β和TNF-α，進(jìn)而發(fā)揮其抗炎效應(yīng)。
　　3、采用DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎，使用不同劑量的Fag提取物和柳氮磺吡啶，觀察小鼠體重變化，結(jié)腸長度，結(jié)腸組織H&E染色，測定結(jié)腸髓過氧化物酶(MPO)活性，促炎細(xì)胞因子mRNA在結(jié)腸中表達(dá)情況、結(jié)腸組織中緊密連接蛋白ZO-1，Occluidn表達(dá)，以FD4為底物研究其胃腸道通透性

8、，血漿中的LPS、IL-6、TNF-α和IL-10水平，并對其結(jié)腸組織中NF-κB的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明金蕎麥提取物可顯著改善由DSS誘導(dǎo)的小鼠體重減輕、結(jié)腸縮短，降低結(jié)腸病理評分及MPO活性。同時金蕎麥提取物可顯著抑制DSS引起的小鼠結(jié)腸組織中IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)，增加IL-10的mRNA在結(jié)腸組織中的表達(dá)，抑制結(jié)腸組織中NF-κB表達(dá)，降低DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血漿中LPS、IL-6和TNF-α的濃度。此外金蕎

9、麥提取物還可以顯著降低由DSS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障功能損傷，并增加緊密連接蛋白ZO-1和occludin在結(jié)腸組織中的表達(dá)。
　　4、采用LPS分別刺激RAW264.7細(xì)胞，THP-1細(xì)胞，研究金蕎麥提取物(5，10，20，50μg/mL)對IL-6和TNF-α分泌的影響、Cox-2和iNOS的表達(dá)、NF-κB核易位情況及對核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(Nucleotide-binding oligomerization domai

10、n-like receptor3，NLRP3)信號通路的影響。結(jié)果表明金蕎麥提取物可劑量依賴性的降低IL-6和TNF-α的分泌，抑制由LPS誘導(dǎo)的Cox-2和iNOS表達(dá)上調(diào)，同時金蕎麥提取物可顯著抑制NF-κB的核易位，可能與其抑制IκB磷酸化有關(guān)。此外在THP-1細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)，金蕎麥提取物可以顯著抑制Cleaved Caspase-1，IL-1β，NLRP3和ASC的相對蛋白表達(dá)量，從而發(fā)揮其抗炎作用。
　　結(jié)論：