同源序列高劑量異常表達(dá)及病毒編碼蛋白對基因沉默的作用.pdf

1、RNA沉默是生物體中普遍存在的一種由同源序列引起的RNA降解過程,病毒或轉(zhuǎn)座子入侵、以及體內(nèi)產(chǎn)生的各種異常結(jié)構(gòu)RNA都可能成為誘導(dǎo)RNA沉默發(fā)生的因素.為了認(rèn)識同源性RNA的結(jié)構(gòu)形式和表達(dá)劑量對誘發(fā)植物基因沉默的影響,以及某些植物病毒編碼蛋白對基因沉默的抑制作用,為深入了解植物基因沉默的機(jī)制提供更多的資料,該論文就以下內(nèi)容開展了研究.分別以低拷貝(pBIN19)和單拷貝(pMW75515J)的雙元載體為骨架,構(gòu)建了NOS終止子缺失的GF

2、P基因(GFP-ΔTnos)表達(dá)載體.采用農(nóng)桿菌浸潤法(agro-infiltration)感染轉(zhuǎn)基因本生煙16C,并對同源基因瞬時(shí)表達(dá)所引起的植物表型變化、小分子RNA的產(chǎn)生、DNA甲基化程度、以及相關(guān)性狀在后代中的遺傳情況進(jìn)行了檢查.根據(jù)發(fā)生沉默的時(shí)間早晚、發(fā)生沉默的植株比例以及程度的觀察,發(fā)現(xiàn)GFP-ΔTnos載體誘發(fā)同源基因沉默的效率明顯高于含有完整表達(dá)單元的同類載體;低拷貝載體誘發(fā)同源基因沉默的效率明顯高于含有相同表達(dá)單元的單

3、拷貝載體.在發(fā)生沉默的植株體內(nèi),在GFP蛋白及RNA被不同程度降解的同時(shí),可以檢測到21-26nt的小分子RNA(siRNA),同時(shí)GFP基因編碼區(qū)也受到顯著地甲基化修飾.這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)現(xiàn)象可以在植株體內(nèi)系統(tǒng)傳播,但不能遺傳給后代.接種野生型本生煙后的RT-PCR結(jié)果表明,GFP-ΔTnos載體瞬時(shí)表達(dá)所產(chǎn)生的GFP RNA可能沒有poly(A)尾序.以上結(jié)果表明,同源性基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)形式及其在植物體內(nèi)的表達(dá)劑量是影

4、響PTGS能否發(fā)生以及發(fā)生程度的兩種互相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵因素.獲得了含有GFP-ΔTnos表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因本生煙,在部分轉(zhuǎn)基因株系中GFP基因的表達(dá)受到抑制.Northern分析顯示:GFP-ΔTnos載體所表達(dá)的GFP基因產(chǎn)物多數(shù)滯留在細(xì)胞核內(nèi)部,不能被運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)中.篩選含有單個(gè)GFP基因(GFP1)或3個(gè)串聯(lián)重復(fù)GFP基因(GFP3)的轉(zhuǎn)基因煙草,獲得熒光表型基本一致的純合株系.用含有GFP基因的PVX病毒載體(PVX-GFP)接種后,

5、GFP3株系對PVX-GFP侵染的抵抗能力明顯高于GFP1株系.分子檢測結(jié)果顯示,GFP3植株中普遍存在GFP基因的沉默現(xiàn)象,且GFP DNA的甲基化程度明顯高于GFP1植株,說明這些植株對于病毒的抗性與目的基因的插入位點(diǎn)及拷貝數(shù)和無關(guān),但與串聯(lián)重復(fù)的GFP基因結(jié)構(gòu)形式密切相關(guān).將RBSDV S6基因組分和BNYVV RNA2的14kD蛋白基因分別插入經(jīng)改造的PVX病毒載體,與正常的GFP表達(dá)載體共侵染本生煙.表型觀察和分子檢測表明,S