基因序列多態(tài)性對易感基因的功能作用及其對病毒抵抗RNAi的影響.pdf

1、基因序列多態(tài)性對易感基因的功能作用及其對病毒抵抗RNAi的影響隨著人類基因組計劃的進展,基因序列多態(tài)性在復(fù)雜性狀疾病的發(fā)病機制、藥物敏感性的個體差異、病毒的生存與耐受等方面具有廣闊前景。本課題通過研究人基因5'UTR啟動子區(qū)SNP多態(tài)性位點對基因轉(zhuǎn)錄影響、3'UTR區(qū)插入/缺失多態(tài)性位點對基因表達的影響以及RNA病毒基因組序列的變異對RNAi抑制轉(zhuǎn)錄作用的影響這三個角度,驗證了基因序列多態(tài)性對不同層面基因表達調(diào)控的功能作用,從而為復(fù)雜性

2、狀疾病的發(fā)病機制以及病毒對基因治療產(chǎn)生耐受機制做出有益的探索。 第一部分：位于人基因5'UTR區(qū)SNP對TNF-α基因表達的影響研究 目的：腫瘤壞死因子-alpha(TNF-α)作為促炎細胞因子參與自身免疫性疾病和感染性疾病的致病過程,最近的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α基因上游啟動予區(qū)-857T等位基因與自發(fā)性急性前葡萄膜炎、成人重癥腹膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病相關(guān)。而且,本教研室前期對漢族人群強直性脊柱炎與T

3、NF-α單核苷酸多態(tài)性及單倍型的關(guān)聯(lián)分析表明,在TNF-α啟動子區(qū)-857C→T是TNF-α獨立于HLA-B27而與強直性脊柱炎相關(guān)的最有可能的SNP位點。以上的多種報道,很可能是由于TNF-α的-857SNP參與了TNF-α的表達過程,從而使其與多種疾病相關(guān)。本課題旨在檢測次等位基因-857T,與主等位基因-857C相比,是否對人TNF-α表達產(chǎn)生影響。 研究方法：在RAW264.7與HeLa細胞中,運用報告基因方法檢測其對轉(zhuǎn)

4、錄的影響；運用實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法和酶聯(lián)免疫吸附法,分別從mRNA和蛋白水平,對健康對照個體(基因型為-857C/C)與強直性脊柱炎病人(基因型為-857C/T)外周血單個核細胞中TNF-α表達水平進行了比較。 結(jié)果：報告基因檢測結(jié)果表明,與主等位基因-857C比較,次等位基因-857T對TNF-α啟動子具有更強的轉(zhuǎn)錄激活作用：在基因型為-857C/C的健康人以及-857C/T的強直性脊柱炎病人PBMCs之間,TNF-α在m

5、RNA和蛋白水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異。 結(jié)論：研究表明TNF-α啟動子-857T次等位基因可能直接對TNF-α具有調(diào)控作用,且可能以組織特異性方式進行；在解釋TNF-α與AS相關(guān)時,除TNF-α啟動子-857SNP之外,也可能存在其它確切影響TNF-α表達的因素。 第二部分：位于人基因3'UTR區(qū)ins/del插入缺失多態(tài)性對IGF-2R基因表達的影響研究 目的:microRNAs(miRNAs)主要通過轉(zhuǎn)錄后翻譯水平

6、的抑制作用調(diào)控人內(nèi)源性基因的表達并參與重要的生理、病理過程,最新研究表明位于靶基因3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的DNA序列多態(tài)性(DSPs)可能參與這些過程。Villuendas et al.等研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病與胰島素樣生長因子2受體(IGF2R)基因3'UTR的ACAA-插入/缺失多態(tài)性有關(guān),但機制未明。本課題旨在檢測ACAA-插入/缺失多態(tài)性是否存在miRNA介導(dǎo)的多態(tài)性調(diào)控模式。 研究方法：本研究中,使用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測工具mic

7、roInspector和miRanda預(yù)測能與IGF2R基因的DNA序列多態(tài)性ACAA-插入/缺失位點結(jié)合的miRNAs分子；熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測候選miRNAs對IGF2R的3'UTR作用以及ACAA-插入/缺失變異對此作用的影響：用RT-qPCR及ELISA方法分別檢測HepG2細胞中轉(zhuǎn)染候選miRNAs后IGF2R的mRNA與蛋白質(zhì)水平變化。 結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測表明IGF2R基因的ACAA-插入/缺失位點位于hsa-

8、miR-657和hsa-miR-453的結(jié)合位點內(nèi)；報告基因?qū)嶒灡砻?hsa-miR-657通過多態(tài)性模式調(diào)控IGF2R基因的表達,即與ACAA插入相比,ACAA缺失對轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生了更高的抑制作用；mRNA與蛋白質(zhì)水平定量分析表明,hsa-miR-657對IGF2R的mRNA水平無影響,而減少可溶性IGF2R水平。 結(jié)論：本實驗證實,ACAA-插入/缺失多態(tài)性,至少可能通過hsa-miR-657介導(dǎo)調(diào)控方式,引起IGF2R表達水

9、平的變化。這可能在機制上部分的解釋了2型糖尿病的發(fā)病,并提示miRNAs或與功能性DNA序列多態(tài)性協(xié)同,在2型糖尿病的防治中具有一定的應(yīng)用價值。 第三部分：位于FMBV的VP1基因區(qū)的序列變異位點對siRNAs抑制病毒復(fù)制作用的影響研究 目的：自從在植物與脈孢菌中發(fā)現(xiàn)了雙鏈RNA誘導(dǎo)的基因沉默,以及在蠕蟲秀麗隱桿線蟲中對RNA干擾現(xiàn)象的機制做出決定性的闡釋以來,RNA干擾不僅是研究內(nèi)源性基因功能的重要工具,而且已被作為實

10、驗室強大的抗病毒工具,并對病毒感染提供了一種新的治療手段。本課題旨在篩選能有效抑制口蹄疫病毒的siRNAs分子并檢測FMDV病毒基因組序列的變異對RNAi效果的影響。 研究方法：本課題運用體外重組報告基因?qū)嶒灪土魇郊毎g(shù),以及對攻毒BHK-21細胞進行FMDV含量、上清病毒滴度、細胞病理效應(yīng)等檢測手段,篩選對FMDV的VP1基因起明顯抑制作用的siRNAs分子；同時,用定點突變重組報告基因方法檢測FMDV基因序列變異對siRNA

11、s抑制作用的影響。 結(jié)果：篩選到3個能短暫抑制FMDV的有效siRNAs分子；對FMDV基因組序列分析發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒的VP1基因序列中第410位點變異,且經(jīng)報告基因?qū)嶒炞C實其可減弱siRNA對VP1基因的抑制作用。 結(jié)論:FMDV基因組內(nèi)siRNA結(jié)合區(qū)的變異可導(dǎo)致siRNA抑制效果的減弱；提示對抗病毒的復(fù)制應(yīng)使用新一代識別突變位點的siRNAs分子。 總之,通過本課題的研究,分別驗證了三種不同形式的基因序列多態(tài)

12、性對基因表達的功能影響,并揭示出其在致病過程及病毒耐受中的機制模型:TNF-α基因啟動子區(qū)順式作用元件內(nèi)的-857的單核苷酸多態(tài)性改變了基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性而可能參與易感基因TNF-α對強直性脊柱炎的致病作用；IGF2R的3'UTR的插入/缺失多態(tài)性改變了miRNA對IGF2R基因翻譯水平的抑制作用機制而可能參與2型糖尿病的發(fā)病；口蹄疫病毒的VP1基因序列中第410位點變異可能減弱siRNA抑制病毒復(fù)制的效力,提示新一代識別突變位點的s