鼻咽癌易感基因miRNA結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性研究.pdf

1、microRNAs（miRNA）是一種內(nèi)源性的長(zhǎng)22nt的單鏈小分子RNA，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。miRNA通過與靶基因mRNA3’非翻譯區(qū)（3'Untranslated regions，3'UTR）的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA或抑制翻譯，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA與靶基因結(jié)合的關(guān)鍵部位稱為“種子區(qū)域”（seed region miRNA5’末端開始2-7個(gè)核甘酸），與miRNA3'UTR通過堿基配對(duì)結(jié)合。單核甘酸多態(tài)性

2、是（SNPs）人類可遺傳的變異中最常見的一種，前期研究已經(jīng)證實(shí)miRNA靶位點(diǎn)序列中，存在有功能的SNPS。那么位于miRNA靶標(biāo)位點(diǎn)的SNP會(huì)不會(huì)影響miRNA的功能及靶基因的表達(dá)昵？從2007年開始，部分學(xué)者開始從事這方面的研究，最近的研究已經(jīng)證實(shí)了某些miRNA靶標(biāo)位點(diǎn)的SNP與乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃腸癌發(fā)病有關(guān)。 然而，miRNA靶位點(diǎn)的單核酸多態(tài)性對(duì)鼻咽癌的發(fā)病是否有影響，與疾病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系目前仍知之甚少，

3、因此本研究的目的是通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、篩選鼻咽癌易感基因3'UTR潛在的microRNA靶位點(diǎn)，并發(fā)掘靶標(biāo)區(qū)域SNP位點(diǎn)，結(jié)合病例一對(duì)照研究，探討miRNA靶標(biāo)位點(diǎn)基因多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)病的關(guān)系。 首先通過文獻(xiàn)回顧，我們總結(jié)了鼻咽癌的七大特征所涉及到的82個(gè)易感基因：持續(xù)生成新生血管、逃避凋亡、生長(zhǎng)信號(hào)的自足性、抗生長(zhǎng)信號(hào)的不敏感性、無限增殖潛能、組織侵襲與轉(zhuǎn)移、腫瘤相關(guān)的炎癥等。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了82個(gè)候選基因3'UTR的

4、SNPs，利用miRanda，PicTar，TargetScans，和RNAfold webserve網(wǎng)站預(yù)測(cè)SNP位點(diǎn)的microRNA靶標(biāo)和自由能，以與“種子”序列嚴(yán)格堿基互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)作為候選microRNA靶位點(diǎn)。最終在82個(gè)基因里找到220個(gè)SNPs存在于潛在的miRNA靶位點(diǎn)中，挑選在鼻咽癌中高表達(dá)，3'UTRSNP等位基因頻率（MAF>0.05）且miRNA結(jié)合自由能相對(duì)較小的9個(gè)基因（EGFR，COX2，CCNE1，hT

5、ERT，MMP2，MMP9，NF-κB VEGF and WNT3）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 實(shí)驗(yàn)首先隨機(jī)選取12例患者和12例對(duì)照DNA，通過直接測(cè)序法篩選9個(gè)候選基因3'UTR的SNPs，結(jié)果篩選出EGFR rs884225，CCNE1 rs3218073 and MMP2 rs72013個(gè)SNPs用于下一步實(shí)驗(yàn)。然后，采用病例-對(duì)照的研究方法，選取廣東地區(qū)167例鼻咽癌患者和171例正常對(duì)照為研究對(duì)象，針對(duì)已經(jīng)篩選出來的SNPs進(jìn)行

6、批量PCR擴(kuò)增和測(cè)序分型。 研究結(jié)果表明：在鼻咽癌總體樣本中CCNE1基因多態(tài)位點(diǎn)（rs3218073）中，攜帶T等位基因的基因型TC+TT（OR=1.585；95% CI=1.023～2.458 P=0.046），及等位基因T（OR=1.464，95% CI=1.012～2.118；P=0.042）顯著增加了鼻咽癌患病風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步分層分析表明，雜合子變異型TC（OR=1.959，P=0.043）和等位基因T（OR=2.123，

7、P=0.006）在原發(fā)腫瘤T3-T4分期中分布明顯，此外，基因型TC（OR=1.959，P=0.043）和等位基因T（OR=2.123，P=0.006）與較晚臨床分期（Ⅲ-Ⅳ期）有關(guān)。MMP2 rs7201位點(diǎn)基因型分析，選取了116例鼻咽癌患者和143例正常對(duì)照，MMP2 rs7201多態(tài)性與鼻咽癌易感性不存在關(guān)聯(lián)，（雜合子變異型AC OR=0.69，95% CI=0.404～1.124，p=0.209；等位基因C OR=0.769，

8、95%CI=0.509～1.161，p=0.135）。以167例鼻咽癌患者和171例為研究對(duì)象分析EGFR多態(tài)位點(diǎn)（rs884225）基因型分布，EGFR rs884225多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（雜合子AG OR=1.375，95% CI=0.850～2.224 p=0.194；純合子變異型GG OR=0.844，95% CI=0.460～1.550 p=0.584；等位基因G OR=0.969，95%CI=0.714～1.