低劑量輻射(LDR)對(duì)DNA-PKcs基因沉默人乳腺上皮細(xì)胞DNA修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、乳腺癌通常指發(fā)生在乳房腺上皮組織的惡性腫瘤。全世界每年患乳腺癌的婦女多達(dá)120萬(wàn)人，且發(fā)病率以每年0.2％～8％的速度上升。在美國(guó)，乳腺癌一直處于女性癌癥的第一位，而我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率也有逐年增高趨勢(shì)，現(xiàn)已位于女性癌癥第二位，僅次于子宮癌，是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤。
　　 目前，乳腺癌主要采用手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療(簡(jiǎn)稱化療，Chemotherapy)和放射治療(簡(jiǎn)稱放療，Radiotherapy

2、)等綜合治療體系。放療作為乳腺癌治療最為有效的手段之一，可減少?gòu)?fù)發(fā)率和死亡率，在乳腺癌治療中起到了十分重要的作用。但是，放療在最大限度地控制腫瘤的同時(shí)也會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生放射旁效應(yīng)(放療的副作用)。放射旁效應(yīng)主要是指，在對(duì)癌細(xì)胞DNA作為靶點(diǎn)輻射時(shí)，對(duì)周圍正常細(xì)胞DNA造成損傷的效應(yīng)，即由低劑量放射(low dose radiation，LDR)所引起的DNA雙鏈斷裂(dodble-strand breaks，DSBs)。靶點(diǎn)周圍正常

3、細(xì)胞對(duì)DSBs的修復(fù)是降低放療副作用的最佳途徑，因此，研究低劑量輻射的DNA修復(fù)機(jī)制具有重要的意義。
　　 細(xì)胞對(duì)DSBs損傷的修復(fù)方式主要有兩種：以DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependentprotein kinase，DNA-PK)為主的非同源性末端連接(Nonhomologous end-ioinin，NHEJ)修復(fù)和以ATM為主的同源重組(Homologous recombination，HR)修復(fù)。ATM(atax

4、ia-telangiectasia-mutanted)蛋白激酶是HR修復(fù)修通路的關(guān)鍵蛋白，它是毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變基因(atm)編碼的一種磷酸化的大分子核磷蛋白，分子量約為350kD。ATM作為P53的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要功能是參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA損傷識(shí)別和修復(fù)。盡管ATM介導(dǎo)的HR修復(fù)通路可恢復(fù)DNA鏈的連續(xù)性，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞DSBs修復(fù)過程中，NHEJ途徑起主要作用。
　　 NHEJ修復(fù)途徑主要依賴4個(gè)核心因子

5、：DNA-PK、XRCC4、DNA連接酶IV和Artemis。其中DNA-PK包含一個(gè)具有絲/蘇氨酸激酶活性的催化亞基DNA-PKcs和兩個(gè)能啟動(dòng)NHEJ修復(fù)的Ku亞基。DNA-PKcs是一個(gè)重要的損傷修復(fù)蛋白，除在NHEJ、VDJ重組和維持端粒結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用外，還可磷酸化諸多轉(zhuǎn)錄因子和修復(fù)因子。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DNA-PK表達(dá)缺失或下調(diào)不僅表現(xiàn)出DSBs修復(fù)障礙，還可使細(xì)胞對(duì)低劑量的電離輻射的敏感性增加，提示它在細(xì)胞對(duì)LDR進(jìn)行應(yīng)答

6、中起到重要的作用，與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系，其作用機(jī)制是近年來(lái)國(guó)際關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 本研究模擬乳腺放療中的放射旁效應(yīng)，以人乳腺上皮細(xì)胞系(MCF10)為對(duì)象，首先研究了低劑量輻射對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響；然后，檢測(cè)了不同的DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路(HR和NHEJ通路)、增殖信號(hào)通路(MAPK/ERK通路)以及生存信號(hào)通路(PI3K/AKT通路)中主要信號(hào)蛋白表達(dá)的變化，確定低劑量輻射的信號(hào)分子效應(yīng)；進(jìn)一步利用siRNA干

7、擾技術(shù)沉默人乳腺細(xì)胞DNA-PKcs基因，觀察了DNA-PKcs基因沉默細(xì)胞對(duì)LDR的敏感性以及DSBs修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響，探討了人乳腺上皮細(xì)胞對(duì)LDR敏感性變化的可能機(jī)制以及DNA-PKcs的作用，旨在了解正常人乳腺上皮細(xì)胞對(duì)LDR造成細(xì)胞DSBs后的反應(yīng)以及DNA修復(fù)的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)主要分為兩部分：
　　 (一)LDR對(duì)人乳腺上皮細(xì)胞DNA修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 用50cGy和100cGy照射人乳腺上皮細(xì)胞

8、，MTT法觀察LDR對(duì)乳腺細(xì)胞增殖以及倍增時(shí)間的影響以檢測(cè)細(xì)胞對(duì)LDR的敏感性變化，Western blot檢測(cè)了LDR誘導(dǎo)的不同時(shí)間點(diǎn)(2小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí))DNA-PKcs和ATM介導(dǎo)的DNA修復(fù)通路、MAPK介導(dǎo)的增殖通路、PI3K/AKT介導(dǎo)的生存通路以及Cav-1和NF-kB等相關(guān)蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果表明：(1)50cGy和100cGy照射后，細(xì)胞增殖均受到抑制，100cGy的抑制作用明顯，提示，乳腺細(xì)胞對(duì)

9、LDR的敏感性具有劑量依賴性。(2)100cGyγ射線輻射可引起乳腺細(xì)胞內(nèi)ATM、P53、DNA-PKcs等DNA修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加，提示低劑量引起DNA-DSBs的修復(fù)既可以通過HR，也可以通過NHEJ通路完成。(3)100cGyγ射線輻射可引起乳腺細(xì)胞MAPK、AKT蛋白活性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和乳腺癌抑癌基因Cav-1表達(dá)增加，提示LDR對(duì)乳腺細(xì)胞的效應(yīng)與Cav-1介導(dǎo)的增殖和存活通路與DNA修復(fù)通路的共同作用有關(guān)。

10、r>　　 結(jié)論：LDR能夠引起人乳腺上皮細(xì)胞DNA損傷，增加細(xì)胞的輻射敏感性，其修復(fù)機(jī)制是HR和NHEJ通路被激活，細(xì)胞增殖和存活相關(guān)蛋白也參與LDR引起的損傷修復(fù)和調(diào)節(jié)。
　　 (二)LDR對(duì)DNA-PKcs基因沉默的乳腺上皮細(xì)胞DNA修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　 利用siRNA干擾技術(shù)使人乳腺上皮細(xì)胞DNA-PKcs基因沉默，用50cGy和100cGy照射細(xì)胞，MII法觀察LDR對(duì)乳腺細(xì)胞增殖的影響，Western

11、 blot檢測(cè)DNA修復(fù)相關(guān)蛋白ATM、Ku80和P53等表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果表明：(1)成功地建立了DNA-PKcs基因沉默細(xì)胞模型(MCF10pk)，DNA-PKcs基因表達(dá)比對(duì)照下調(diào)90％；(2)DNA-PKcs基因沉默細(xì)胞MCF10pk對(duì)100cGy LDR輻射敏感度增大，細(xì)胞生長(zhǎng)減慢；(3)LDR均可使MCF10細(xì)胞P53蛋白、Ku80等DNA修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)增多，但DNA-PKcs基因沉默細(xì)胞MCF10pk中的蛋