草莓鑲脈病毒編碼的P6蛋白是RNA沉默抑制子.pdf

1、基因沉默是植物依賴核酸序列特異性互作降解外源RNA來抵御病毒入侵的防御機(jī)制，許多植物病毒針對(duì)這種機(jī)制進(jìn)化出一種反防御機(jī)制，即編碼不同的沉默抑制子來抑制基因沉默的發(fā)生。草莓鑲脈病毒(SVBV)是一種能夠侵染草莓的潛隱性病毒，經(jīng)常給生產(chǎn)帶來巨大損失。SVBV P6基因編碼的P6蛋白除了是癥狀決定因子以外，還可能是RNA沉默抑制子。本研究以植物表達(dá)載體攜帶的SVBV中國(guó)分離物P6基因及其突變分別驗(yàn)證P6蛋白的抑制子功能，最終在分子水平明確P6

2、蛋白作用的機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步研究病毒和寄主植物之間的防御和反防御機(jī)制以控制病毒病的危害都有非常重要的意義。
　　 1.SVBV中國(guó)分離物P6基因及其缺失突變體植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 提取感染中國(guó)SVBV草莓葉片的總DNA，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增P6全長(zhǎng)基因并進(jìn)行無義突變，將得到的目的基因P6和缺失突變體基因△P6克隆到植物表達(dá)載體pCAM-2300和pGR-106上，篩選陽性克隆，得到植物表達(dá)載體pCAM-CH P6、pCAM

3、-CH△P6、pGR-CH P6、pGR-CH△P6。
　　 2.局部沉默試驗(yàn)的GFP熒光觀察與Real-time PCR檢測(cè)
　　 植物表達(dá)載體pCAM-CH P6、pCAM-CH△P6導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，采用瞬間浸潤(rùn)的方法分別接種轉(zhuǎn)GFP基因本氏煙16c(轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙)的葉片，以含重組質(zhì)粒pCAM-P19和空載體pCAM-2300的農(nóng)桿菌作為對(duì)照。接種3d后于紫外燈下觀察，浸潤(rùn)部位都產(chǎn)生綠色熒光現(xiàn)象，

4、且亮度差異不大；接種6 d后于紫外燈下觀察，pCAM-P19和pCAM-CH P6接種的轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙葉片的浸潤(rùn)部位出現(xiàn)明顯的綠色熒光亮度，且前者稍強(qiáng)，pCAM-CH△P6和pCAM-2300接種的轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙葉片浸潤(rùn)部位綠色熒光褪去，邊緣出現(xiàn)明顯的紅色邊界；拍照保存。
　　 提取各株病汁液和葉片浸潤(rùn)區(qū)域的總RNA。利用和Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)GFP基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GFP基因在接種pC

5、AM-P19的轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙葉片浸潤(rùn)區(qū)域具有很高的轉(zhuǎn)錄水平，在接種pCAM-CH P6的轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙葉片浸潤(rùn)區(qū)域也具較高的轉(zhuǎn)錄水平，但比前者稍低；在接種pCAM-CH△P6和pCAM-2300的轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙葉片浸潤(rùn)區(qū)域中轉(zhuǎn)錄水平很低。
　　 3.系統(tǒng)沉默及回復(fù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、GFP熒光觀察
　　 含植物表達(dá)載體pCAM-GFP的農(nóng)桿菌：EHA105接種23株轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙葉片，

6、接種15 d后于紫外燈下觀察，發(fā)現(xiàn)其中15株開始發(fā)生沉默，接種30 d后完全沉默即發(fā)生系統(tǒng)沉默，沉默率達(dá)到60.87％，其余8株始終未發(fā)生沉默。
　　 含植物表達(dá)載體pGR-CH P6和pGR-CH△P6的農(nóng)桿菌EHA105各接種2株轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙葉片，接種15 d后4株轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙全株都出現(xiàn)花葉癥狀，于紫外燈下觀察，發(fā)現(xiàn)均未重新出現(xiàn)綠色熒光。
　　 4.沉默信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn)的GFP熒光觀察與Real-

7、time PCR檢測(cè)
　　 以含植物表達(dá)載體pCAM-CH P6和pCAM-GFP的農(nóng)桿菌EHA105，分別接種轉(zhuǎn)GFP基因16c本氏煙的不同部位的葉片和相同葉片的不同部位。15 d后于紫外燈下觀察16c頂端未浸潤(rùn)葉片是否出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)pCAM-CH P6接種上部葉片pCAM-GFP接種下部葉片和pCAM-CH P6接種葉片基部pCAM-GFP接種葉片尖部的植株頂端未浸潤(rùn)葉片都未出現(xiàn)沉默現(xiàn)象，pCAM-CH P6接

8、種下部葉片pCAM-GFP接種上部葉片和pCAM-CH P6接種葉片尖部pCAM-GFP接種葉片基部的植株頂端未浸潤(rùn)葉片都出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。
　　 分別采樣并提取各植株頂端未浸潤(rùn)葉片的總RNA，利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)GFP基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GFP基因在pCAM-CH P6接種上部葉片、pCAM-GFP接種下部葉片和pCAM-CH P6接種葉片、基部pCAM-GFP接種葉片尖部的植株頂端未浸潤(rùn)葉片具有很高的轉(zhuǎn)錄