黃瓜花葉病毒2b蛋白的RNA沉默抑制子活性與其小RNA結合能力的相關性研究.pdf

1、病毒侵染激發(fā)小干擾RNA（small inteferring RNA,siRNA）介導的寄主抗病毒防御（即寄主抗病毒RNA沉默），從而減弱或抑制病毒的侵染。為了克服抗病毒RNA沉默，植物病毒通常編碼1或多個 RNA沉默抑制蛋白抑制或減弱 RNA沉默的功能，從而使得病毒能夠有效地侵染和復制。黃瓜花葉病毒（CMV）編碼的2b蛋白是最早被鑒定的RNA沉默抑制子之一。令人感興趣的是：CMV亞組I和亞組Ⅱ株系編碼的2b蛋白表現(xiàn)出差異的RNA沉默抑

2、制子活性；而且，亞組Ⅱ株系不能有效地干擾microRNA功能。但是，亞組I和亞組Ⅱ株系編碼的2b蛋白抑制RNA沉默能力差異的機制仍有待闡釋。
　　競爭性結合小RNA（smallRNA，sRNA）被認為是CMV2b蛋白抑制RNA沉默的主要途徑。本論文以CMV亞組IA株系Fny和亞組Ⅱ株系LS編碼的2b蛋白作為研究對象，從sRNA結合能力這個方面分析CMV亞組I和亞組II株系編碼的2b蛋白表現(xiàn)差異的RNA沉默抑制子活性的分子機制。我們

3、已經證實了Fny2b在抑制dsFP和FP誘導的GFP基因沉默方面均比LS2b具有更強的抑制能力。為了說明二者抑制RNA沉默能力的差異是否與結合sRNA的能力相關，我們將Fny2b和LS2b克隆到原核表達載體pGEX4T-1中進行原核表達；然后，將純化的Fny2b和LS2b蛋白與小RNA進行體外結合，通過電泳泳動遷移試驗（EMSA）檢測，結果表明：Fny2b結合雙鏈miRNA（double-stranded miRNA，dsmiRNA），

4、雙鏈siRNA（double-stranded siRNA，dssiRNA）以及單鏈miRNA（single-stranded miRNA，ssmiRNA）的能力均強于LS2b。據此我們推斷：Fny2b和LS2b沉默抑制子能力差異與結合sRNA能力差異有關。
　　本研究中我們還對Fny2b和LS2b結合sRNA的關鍵結構域進行了研究，通過對Fny2b和LS2b進行片段交換，構建重組2b蛋白，經sRNA與2b蛋白體外結合并EMSA實

5、驗檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ny2bN端12個氨基酸與LS2b的N端12個氨基酸互換后，不影響Fny2b和LS2b結合sRNA的能力；而用LS2bN端47個氨基酸替換Fny2bN端47個氨基酸后，該重組2b表現(xiàn)為與LS2b同等弱的sRNA結合能力。由此我們推測N端13～47位氨基酸序列的差異是Fny2b和LS2b呈現(xiàn)不同sRNA結合能力的關鍵結構域；另外，我們將位于Fny2b和LS2b結合sRNA的關鍵結構域內的N端第33、36和46位的精氨酸突變?yōu)?/p>

6、丙氨酸和第41位脯氨酸替換為丙氨酸，并測試了這些突變體的VSR活性。這些突變在不同程度上削弱了Fny2b和LS2b抑制寄主RNA沉默的能力;其中，第33和36位的精氨酸對Fny2b和LS2b抑制寄主RNA沉默能力很關鍵，且第36位精氨酸的影響更大。
　　綜上所述，通過本論文的研究，我們發(fā)現(xiàn)Fny2b和LS2b在抑制寄主RNA沉默能力方面的差異與它們結合sRNA的能力不同有關；結合sRNA能力的差異與其N端13-47位氨基酸序列有關