黃瓜花葉病毒與番茄不孕病毒RNA重組機(jī)制的初步探討.pdf

1、病毒起源和進(jìn)化的歷程預(yù)示著病毒未來的變異方向，病毒的進(jìn)化往往產(chǎn)生致病性更強(qiáng)的新毒株，因此了解病毒變異進(jìn)化的規(guī)律，有助于制定更有針對(duì)性的抗病毒策略，避免病毒病的大面積暴發(fā)流行。大多數(shù)植物病毒為 RNA 病毒，而 RNA 重組是 RNA 病毒進(jìn)化的主要方式之一。RNA 重組的現(xiàn)象在越來越多的 RNA 病毒中得到證實(shí)，但重組機(jī)制尚不完全清楚。本研究以黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和番茄不孕病毒（Tomato

2、 aspermy virus，TAV）---兩種同屬 RNA基因組病毒為研究對(duì)象，通過體外轉(zhuǎn)錄獲得 CMV RNA1、CMV RNA2及 TAV RNA3，組合成假重組病毒，分別接種克氏煙（N.Clevelandii）,通過檢測(cè)重組發(fā)生情況及重組病毒的致病性，對(duì)植物病毒 RNA的重組機(jī)制進(jìn)行了初步探討，具體結(jié)果如下：
　　 （1）以帶有 T7 啟動(dòng)子的病毒基因組 RNA的 cDNA 克隆載體 CMV RNA1，CMV RNA2T

3、2B，CMV RNA2，CMV RNA2W2B和 TAV RNA3△163(A)為模板，體外轉(zhuǎn)錄獲得病毒 RNA，將不同來源的 RNA1，RNA2和 RNA3 進(jìn)行人工組合，獲得 3種假重組體病毒 c2（C1C2 T3△163(A)），qt（C1C2T2BT3△163(A)）和qw（C1C2W2BT3△163(A)）。
　　 （2）將人工構(gòu)建的假重組體 c2，qt，qw分別接種克氏煙，結(jié)果表明，c2（帶有Q-CMV2b）沒有侵染

4、活性，qt（帶有V-TAV2b）和 qw（帶有WAⅡ-CMV2b）在克氏煙上都有侵染活性，qt的侵染癥狀比 qw 更為嚴(yán)重，而且 qt和 qw的侵染癥狀均重于Q-CMV，這表明不同來源 2b蛋白會(huì)影響假重組病毒的癥狀表現(xiàn)。
　　 （3）提取 3種假重組體侵染 14dpi,28dpi和 35dpi 時(shí)的系統(tǒng)發(fā)病葉片總 RNA，分別以 CMV和 TAV 特異性探針進(jìn)行 Northern blot分析，結(jié)果顯示，接種 35dpi 時(shí)

5、qt 在 CMV RNA3的位置出現(xiàn)一條新的 CMV 特異性條帶，但位置在 CMV RNA3條帶之上，RT-PCR及序列比對(duì)分析表明，人工假重組體 qt的 TAV RNA3 與 CMV RNA1之間發(fā)生了重組，表明 TAV2b能促進(jìn) RNA 重組的發(fā)生。此過程涉及多種不穩(wěn)定重組中間體，且重組位點(diǎn)呈現(xiàn)多樣化。
　　 （4）序列分析結(jié)果顯示，重組位點(diǎn)總是分布在 TAV RNA3的 2109nt-2386nt的277
　　 n

6、t的區(qū)間內(nèi)，并且發(fā)生重組的 2條 RNA序列的重組位點(diǎn)附近有同源序列5′-AGGTC
　　 CGAAGACGTTAAACTAC-3′（box1），但是重組位點(diǎn)并不在同源序列內(nèi)，而是位于其下游非同源區(qū)，顯然 box1 并沒有起到促進(jìn)同源重組的作用。其中，最長的重組體的序列是在 TAV RNA3的末端，搭接 CMV RNA1的保守區(qū) 310nt。這種重組方式較為特別，可能是一種新的重組機(jī)制。所有的重組中間體的3′ 端都帶有 Q-CM

7、V RNA的高度保守 TLS序列，可能由于在病毒復(fù)制過程中，起復(fù)制作用的是 CMV 復(fù)制酶，而它對(duì)于 CMV 310nt的起始識(shí)別更有效，而這個(gè)高度保守區(qū)能協(xié)助復(fù)制酶找到編碼閱讀框下游的搭接位點(diǎn)，因而能更好的合成 RNA。
　　 （5）構(gòu)建重組中間體病毒的克隆載體，體外轉(zhuǎn)錄，獲得中間體假重組體病毒。分別侵染克氏煙，癥狀大概一致，均為斑駁，明脈，暗綠等，與 CMV 侵染癥狀類似。結(jié)合 RT-PCR分析，篩選出穩(wěn)定存在的重組病毒 C

8、1C2T2BT3 pRE-8。其RNA3序列與最長的中間體序列一致。推測(cè)可能是 TAV3 pRE-8的 3′ 端的高度保守區(qū)，增加了病毒 C1C2T2BT3 pRE-8的侵染活性，相對(duì)于其他重組中間體更具有競爭優(yōu)勢(shì)，因此穩(wěn)定存活。侵染克氏煙轉(zhuǎn)接四代后，提純病毒，侵染不同種煙草，進(jìn)行癥狀分析。發(fā)現(xiàn) C1C2T2BT3 pRE-8 致使心葉煙（N.Glutinosa）頂端壞死，推測(cè)2b蛋白與寄主的互作促使了壞死的發(fā)生。其他煙草表現(xiàn)為不同程度