Kruppel樣因子8通過(guò)上調(diào)FLT1促進(jìn)769-P腎癌細(xì)胞株體外增殖.pdf

1、目的:在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O細(xì)胞株中瞬時(shí)敲低Kruppel樣因子8(Kruppellike factor8，KLF8)的表達(dá)能夠抑制786-O細(xì)胞系的增值，但KLF8在腎癌中的作用機(jī)制并不清楚，既往的研究表明，在腎癌中VHL突變導(dǎo)致的VEGF/VEGFR、PDGFβ/PAGFRβ、TGF/EGFR過(guò)度激活，在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，本研究旨在探討過(guò)表達(dá)KL8基因?qū)δI透細(xì)胞癌細(xì)胞系769-P的增值能力的影響，以及該作用是否與上

2、述經(jīng)典通路有關(guān)，其作用靶點(diǎn)是什么。
　　方法:應(yīng)用慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建重組KLF8質(zhì)粒，與空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293V細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，再分別感染769-P細(xì)胞株，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real TimePCR)及Western blot技術(shù)檢測(cè)769-P細(xì)胞KLF8的表達(dá)情況。根據(jù)769-P細(xì)胞感染重組KLF8慢病毒或空載體將其分為兩組進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，用平板克隆實(shí)驗(yàn)及MTS方法檢測(cè)769-P細(xì)胞增殖能力的變化，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)

3、檢測(cè)細(xì)胞周期變化。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)潛在靶基因在過(guò)表達(dá)KLF8組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組中的表達(dá)情況。應(yīng)用siRNA(small interference RNA)技術(shù)敲低FLT1后根據(jù)FLT1蛋白表達(dá)量篩選出敲低效果最明顯的siRNA。分別在轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8質(zhì)粒和pLV-EGFP(2A) Puro空載體質(zhì)粒的769-P細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siFLT1，再應(yīng)用平板克隆實(shí)驗(yàn)，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)769-P細(xì)胞株增殖能

4、力的變化。
　　結(jié)果:①成功篩選出高表達(dá)KLF8基因的769-P細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8組的KLF8蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)。②平板克隆實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A)Puro-KLF8組較空載體組克隆數(shù)明顯增多(P＜0.05)。③MTS實(shí)驗(yàn)，在48h、72h、96h的檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)組在490nm吸光值顯著升高(P＜0.05)。④流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)染pLV-EGFP(2A) Puro-KLF8

5、組G0/G1細(xì)胞比例明顯減少S期細(xì)胞比例增加。⑤Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FLT1在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)顯著上升。⑥應(yīng)用siFLT1敲低FLT1后，769-P細(xì)胞株的增值能力明顯下降，平板克隆實(shí)驗(yàn):769P-KLF8+control克隆數(shù)最多，769P-KLF8+siFLT1與769P-EMPTY+control組次之,769-P-EMPTY+siFLT1克隆數(shù)最少;MTS:769P-KLF8+control組于72h，96h時(shí)間點(diǎn)在49