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文檔簡介
1、背景和目的
浸潤和轉(zhuǎn)移可發(fā)生在肝癌的各個階段,是治療腫瘤失敗的常見因素,也是腫瘤病人死亡的主要原因之一。大量研究證實,肝癌的浸潤和轉(zhuǎn)移與肝癌的腫瘤微環(huán)境密切相關,而各種免疫因子、炎癥因子在腫瘤的浸潤和遷移的過程中起重要作用,是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。趨化因子配體CCL18(chemokineCC-motifligand18,CCL18)屬CC族趨化因子,主要由巨噬細胞和樹突細胞(DC)分泌,是新近發(fā)現(xiàn)的炎性趨化因子,在正常人
2、血清中可測得,有研究表明,該因子與胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程密切相關。但有關CCL18在肝癌中的表達及意義的研究在國內(nèi)外尚未見文獻報道,與肝癌的生物學關系尚不明確。本研究通過測定CCL18和它的功能性受體PITPNM3在人肝癌細胞株SMMC-7721中的表達情況,進一步探索CCL18通過其受體在人肝癌細胞株SMMC-7721黏附、遷移和浸潤過程中所起的作用。
材料與方法
1.細胞培養(yǎng):人肝癌
3、細胞株SMMC-7721(細胞購自上海細胞庫)、乳腺癌細胞株MDA-MB-231(細胞購自ATCC)均在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含10%胎牛血清的DMEM),人正常肝細胞株HL-7702(細胞購自上海細胞庫)在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)(含20%胎牛血清的DMEM)。
2.用重組CCL18(50ng/ml)誘導人肝癌細胞株SMMC-77215天后,再將SMMC-7721細胞分成4組,各組分別用不同濃度的CCL18(0、10、20、50ng/m
4、l)處理1小時,檢測其促進細胞的體外黏附能力。
3.用重組CCL18(50ng/ml)誘導人肝癌細胞株SMMC-772110天后,將SMMC-7721細胞株分成4組,各組分別用不同濃度的CCL18(0、10、20、50ng/ml),用Transwell和劃痕實驗檢測細胞的體外遷移和浸潤能力。
4.用westernblot方法檢測趨化因子配體CCL18的功能性受體PITPNM3在肝癌細胞株SMMC-7721的表達。分為
5、三組:人正常肝細胞株HL-7702(陰性對照)、乳腺癌細胞株MDA-MB-231(陽性對照)、肝癌細胞株SMMC-7721(實驗組)。采用免疫熒光法證明CCL18和PITPNM3是否共定位于SMMC-7721細胞的胞膜上。
5.用重組CCL18(50ng/ml)誘導人肝癌細胞株SMMC-772110天,再用小分子干擾RNA(siRNA)沉默受體PITPNM3,分為6組(PBS、Un、Monk、GFP-Si、PITPNM3-Si
6、1、PITPNM3-Si2),觀察SMMC-7721細胞被沉默了受體PITPNM3后的體外浸潤能力。
研究結果
1.重組CCL18誘導肝癌SMMC-7721細胞5天后,發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細胞的粘附力明顯增加,并具有劑量依賴性,差異性比較具有統(tǒng)計學意義(P
7、,發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組比較細胞體外浸潤能力和細胞體外遷移能力明顯增強,同時具顯著劑量依賴性,差異性比較具有統(tǒng)計學意義(P
8、scope,LSCM)證明CCL18和PITPNM3共定位于人肝癌細胞株SMMC-7721的胞膜上。
5.重組CCL18(50ng/ml)誘導人肝癌細胞株SMMC-772110天,再用小分子干擾RNA(siRNA)沉默受體PITPNM3,被沉默了趨化因子CCL18的受體PITPNM3后,SMMC-7721細胞體外浸潤能力明顯下降,差異性比較具顯著統(tǒng)計學意義(P
1.重組CCL18增強了
9、人肝癌細胞株SMMC-7721的體外黏附、遷移和浸潤能力,且呈劑量依賴性。
2.PITPNM3蛋白在人肝癌細胞株SMMC-7721中高表達,并顯著高于人正常肝細胞HL-7702中PITPNM3蛋白的表達水平。
3.CCL18及其功能性受體PITPNM3可表達于人肝癌細胞株SMMC-7721的胞膜上,并能共定位于肝癌細胞膜表面。
4.被沉默了趨化因子CCL18的功能性受體PITPNM3后,人肝癌細胞株SMMC
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