銀杏葉總黃酮的提取及其對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:
　　制備銀杏葉總黃酮粗提取物,通過觀察人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及檢測(cè) Caspase-3、P21基因的表達(dá)影響,檢測(cè)其對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721的抑制作用,并探討其抑制肝癌細(xì)胞增殖與促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,為銀杏葉總黃酮應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療提供一定的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　采用微波輔助法在90％乙醇為提取劑、提取時(shí)間5 min、料液比1:25的提取條件下提取銀杏葉黃酮。培

2、養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞,接種于96孔板中,按藥物濃度梯度分5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(藥物濃度分別為:100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL),另設(shè)不含細(xì)胞的空白對(duì)照組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,另設(shè)不含細(xì)胞的藥物空白孔,分別加入不同濃度的銀杏葉總黃酮溶液作用24h、48h,采用CCK-8法檢測(cè)各種濃度的銀杏葉總黃酮對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響;并通過倒置相差顯微鏡觀察經(jīng)不同濃度的銀杏葉黃酮溶

3、液作用后SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;另將人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中,分別加入不同濃度的銀杏葉總黃酮溶液作用24h后,提取細(xì)胞RNA,用 RT-PCR半定量法進(jìn)行擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄,瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)目的基因Caspase-3、P21的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　采用微波輔助法在90%乙醇為提取劑、提取時(shí)間5 min、料液比1:25的提取條件下為正交實(shí)驗(yàn)篩選得到的最佳提取工藝組,其黃酮得率為1.52

4、%。經(jīng)CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示銀杏葉總黃酮分別作用24h、48h后實(shí)驗(yàn)組中各濃度對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的抑制率均高于空白對(duì)照組,其中24h實(shí)驗(yàn)組中各濃度的抑制率(%)分別為:16.2+2.5、26.9+2.9、42.4+3.1、60.6+3.8、67.2+4.6;48 h后實(shí)驗(yàn)組中各濃度的抑制率(%)分別:25.1+2.1、37.3+3.0、57.1+3.1、73.4+4.6、82.3+5.2。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P<0.01)

5、;銀杏葉黃酮對(duì) SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制率均隨著藥物作用濃度的升高及藥物作用時(shí)間的延長而逐漸升高;倒置相差顯微鏡下均可見細(xì)胞體積縮小,與周圍的細(xì)胞脫離,然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加,細(xì)胞核濃縮、細(xì)胞數(shù)量減少等變化,且隨著作用濃度的增加變化更加明顯。RT-PCR半定量法檢測(cè)到Caspase-3、P21基因的 mRNA表達(dá)量隨藥物濃度增高而增高,瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的 DN A梯度帶形成。不同濃度組的Caspase-3相對(duì)灰度分別:0.3

6、37+0.025、0.446+0.033、0.611+0.028、0.754+0.021、0.858+0.032,與空白對(duì)照組相比(0.137+0.017),差異有顯著性(P<0.01);不同濃度組的 P21相對(duì)灰度分別:0.380+0.031、0.522+0.031、0.690+0.030、0.829+0.035、0.893+0.035,與空白對(duì)照組相比(0.166+0.019),差異有顯著性(P<0.01);
　　結(jié)論:

7、>　　1、本次試驗(yàn)使用微波輔助法提取總黃酮最佳條件組合為:90%的乙醇為溶劑,其中料液比為1:25,微波加熱時(shí)間為5min,最后黃酮得率為1.52%。
　　2、銀杏葉總黃酮在體外具有抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的作用,其作用強(qiáng)度隨藥物濃度增加、藥物作用時(shí)間的延長而增加,呈明顯的藥物濃度、作用時(shí)間的依賴性。
　　3、銀杏葉總黃酮能誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡,其作用強(qiáng)度與藥物濃度相關(guān),呈藥物濃度依賴性。其促