腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、CD105在肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和肝癌組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、背景:癌癥(cancer),即惡性腫瘤(Malignant neoplasm),是由于自身的遺傳和外界環(huán)境的物理、化學(xué)、生物等致癌因素導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)增殖機(jī)制的失控所引起的一類疾病。因細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控失衡,細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)無(wú)限制的大量增殖,造成體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗,破壞正常組織器官的結(jié)構(gòu)和功能,影響鄰近組織器官的正常工作。癌細(xì)胞除了無(wú)限增殖外,多數(shù)還會(huì)經(jīng)淋巴、血液或種植播散等,侵及其他組織器官乃至全身,造成全身的多臟器功能衰竭最終導(dǎo)致死亡。現(xiàn)如今

2、,癌癥已經(jīng)成為人類死亡的主要病因之一,發(fā)病率與死亡率仍居高不下,甚至有上升趨勢(shì)。因此,盡快地明確癌癥的病因和發(fā)病機(jī)制,從根本上有效地治療癌癥是我們共同奮斗的目標(biāo)。
　　隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入和發(fā)展,腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)學(xué)說的提出為研究腫瘤的病因和機(jī)制提供了一個(gè)新的視角。與經(jīng)典的腫瘤學(xué)理論所認(rèn)為的腫瘤是由于成熟細(xì)胞的DNA突變后所造成細(xì)胞的增殖和凋亡失控不同,CSCs學(xué)說認(rèn)為腫瘤僅來自于一

3、小群本身有自我更新和分化潛能的干細(xì)胞,他們的存在與腫瘤的形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)息息相關(guān)。這一小群有著普通干細(xì)胞“干性”腫瘤干細(xì)胞就是今后治療腫瘤的關(guān)鍵所在。這些細(xì)胞在一定的條件下,可以分化成不同表型的腫瘤細(xì)胞,除了分化的方向不同,還能保持新生的細(xì)胞中始終有一小群保持著原有無(wú)限增殖和多向分化的能力,維持腫瘤的進(jìn)一步生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),這些特殊的CSCs可以說是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵所在。
　　目前,經(jīng)過眾多學(xué)者的努力研究,CSCs學(xué)說逐

4、步地在大部分惡性腫瘤中得到證實(shí),根據(jù)其理論衍生出的針對(duì)CSCs精確的靶向治療和誘導(dǎo)分化治療在某些腫瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到很好的效果。能夠精確的篩選出 CSCs是研究 CSCs道路上的關(guān)鍵點(diǎn),也是難點(diǎn)。當(dāng)前篩選這些CSCs主要通過側(cè)群細(xì)胞的篩選(相對(duì)粗糙)和根據(jù)某些特殊的腫瘤干細(xì)胞膜標(biāo)記物篩選(相對(duì)精確)。能否確定某一類腫瘤的特異性的標(biāo)記物進(jìn)行精確地篩選,直接影響今后對(duì)此類腫瘤的治療。
　　雖然有少數(shù)腫瘤的干細(xì)胞標(biāo)記物相對(duì)確定,但是,肝

5、癌作為世界第三大死因的腫瘤,其腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物卻仍處于探索階段。目前,研究相對(duì)集中并且相對(duì)可靠的肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物(live cancer stem cells,LCSCs)主要集中于CD133、CD44、CD90、CD13和EpCAM等。CD133在很多腫瘤的干細(xì)胞中都有一定的表達(dá),尤其在結(jié)直腸癌中,表達(dá)最為顯著。在肝癌中,通過標(biāo)記CD133同樣也能針對(duì)LCSCs進(jìn)行篩選,但是CD133的特異性不夠高。肝癌另一種標(biāo)記物CD105存在于細(xì)

6、胞膜上,與新生血管密切相關(guān),其功能與調(diào)節(jié)腫瘤增殖、分化的TGF-β相關(guān),影響肝癌的轉(zhuǎn)移。此時(shí),我們考慮是否能夠聯(lián)合CD133和CD105兩者針對(duì)肝癌的LSCDs進(jìn)行篩選,提高LSCDs的精確性。同時(shí)我們還研究了CD133和CD105在在肝癌、癌旁、肝硬化和正常肝組織中的表達(dá)情況,并分析兩標(biāo)記物與肝癌的臨床病理因素的關(guān)系。
　　目的：本研究比較了體外條件下CD133和CD105在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的表達(dá)情況及各亞群間生物

7、學(xué)性狀的差異,并初步探討CD133+CD105+的SMMC-7721細(xì)胞亞群的干細(xì)胞特性;檢測(cè)CD133和CD105在肝癌、癌旁、肝硬化和正常肝組織中的表達(dá)情況,并分析兩標(biāo)記物與肝癌的臨床病理因素的關(guān)系。
　　方法：第一,采用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞;流式細(xì)胞分選儀檢測(cè) CD105、CD133表達(dá)情況并分選出 CD133+ CD105+、CD133+CD105-、CD133-CD105+、CD13

8、3-CD105-亞群;通過CCK-8檢測(cè)分選所得的各細(xì)胞亞群及未分選SMMC-7721細(xì)胞每日的OD450數(shù)值,以比較各亞群細(xì)胞增殖能力;通過軟瓊脂克隆培養(yǎng)試驗(yàn)比較各亞群細(xì)胞克隆成球能力。第二,采用免疫組化的方法分析CD133、CD105在肝癌組織、癌旁組織、肝硬化組織、正常肝組織中的表達(dá)情況,分析其與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系及意義。
　　結(jié)果：人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721經(jīng)流式分選得到四種亞群細(xì)胞比例:CD133+C

9、D105+占0.76%、CD133+CD105-占0.01%、CD133-CD105+占98.49%,CD133-CD105-占0.74%;CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)四亞群細(xì)胞存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),以 CD133+CD105+亞群細(xì)胞的增殖能力明顯大于其他亞群細(xì)胞;軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)四亞群細(xì)胞存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),以 CD133+CD105+亞群細(xì)胞的克隆成形能力明顯大于其他亞群細(xì)胞。CDl33和CD105在肝癌組織中的表達(dá)

10、水平均高于癌旁、肝硬化組織及正常肝組織,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。CD133的表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)、有無(wú)門靜脈癌栓、AFP是否≥400的數(shù)值明顯相關(guān)(P<0.05),與患者的性別、年齡、有無(wú)乙型肝炎、有無(wú)肝硬化、腫瘤的大小是否≥5cm、腫瘤有無(wú)包膜及TNM分期未見明顯相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.在人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721中,CD133+、 CD105+、 CD133-CD105-的SMMC-7721細(xì)胞亞群雖然所

11、占比例較高,但增殖和克隆能力較弱,不能真正代表肝癌干細(xì)胞亞群;
　　2.在人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中,CD133+CD105+ SMMC-7721雖然所占比例極低,但具有更強(qiáng)的增殖能力和克隆成形能力,CD133+CD105+細(xì)胞更具有肝癌干細(xì)胞的特性。
　　3.CD133+、CD105+在肝癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織、肝硬化組織、正常肝組織,兩者在肝癌中的高表達(dá)有一致性,CD133+的表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)、靜脈癌栓、